反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的濃度相關研究

摘要：目的 探討分析反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的血藥濃度。方法 將受試者的血漿隨機分成兩組，實驗組用蘭索拉唑，對照組用奧美拉唑，兩組同時以泮托拉唑為內標物，以叔丁基甲醚為提取物，采用反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的血藥濃度。結果 實驗組的線性方程：Y=10.758X+0.006667，相關系數r為0.9998；對照組的線性方程：Y=6.889X-0.000587，相關系數r為0.9999。實驗組的日內精密度<4%，日間精密度<7%；對照組的日內精密度<5%，日間精密度<6%。實驗組的相對回收率98.15%～102.5%；對照組的相對回收率98.01%～101.15%。結論 反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的血藥濃度，方法操作簡單，結果準確，靈敏度高，與奧美拉唑比較無顯著性差異，可以用于藥代動力學研究。

關鍵詞：反相高效液相色譜法；蘭索拉唑；血藥濃度；藥代動力學；奧美拉唑

反相高效液相色譜法（reversed phase high performance liquid chromatography， RP-HPLC）是一種由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系。蘭索拉唑是繼奧美拉唑藥物后的又一種質子泵抑制劑[1]，臨床多將其應用于對胃潰瘍疾病、十二指腸潰瘍疾病、以及反流性食管炎疾病的治療過程當中，患者通過服用蘭索拉唑藥物的方式，能夠自血液進入壁細胞內后部，并且可以支持在堿性環境條件下，實現與質子泵當中（H+/K+）-ATP酶的疏基集合[2]。目前，絕大部分測定人血漿當中蘭索拉唑血藥濃度的方式多為反向液相色譜法，但在操作簡便性與可靠性方面并不理想。為此，本文提出了一種更加快速與簡便的反向高效液相色譜法，并將其應用于對人血漿蘭索拉唑濃度的測定工作中，取得了較為滿意的效果，現總結并報告如下：

1儀器與試劑

1.1儀器 HPLC（高效液相色譜儀）廠家：Waters，檢測器Waters 2487；高速低溫離心機廠家：BECKMAN；超聲清洗器（KQ3200）；渦旋混合器廠家：上海琪特； 電子分析天平（BS124S）廠家：sartorius。

1.2試劑 對照品蘭索拉唑，上海滬宇生物科技有限公司，100709；對照品奧美拉唑，上海滬宇生物科技有限公司，100367；對照品泮托拉唑，上海信然生物科技有限公司，100575；乙腈，上海星可生化科技有限公司，色譜純；其余試劑，分析純；水，蒸餾水。

1.2方法 將受試者的血漿隨機分成兩組，實驗組用蘭索拉唑，對照組用奧美拉唑，兩組同時以泮托拉唑為內標物，以叔丁基甲醚為提取物，采用反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的血藥濃度。

1.2.1色譜條件 色譜柱為安捷倫 Eclipse XDB-Cl8（150 mm×4.6 mm×5 m）；保護柱為安捷倫Eclipse XDB-Cl8（12.5mm×4.6 mm×5 m）；以0.01mol/L磷酸二氫銨（含千分之一正辛胺）：乙腈=66：34為流動相；檢測波長為采用流速1.0ml/min-1；檢驗波長蘭索拉唑6 min～15 min是285nm，奧美拉唑0 min～6 min是305nm；溫柱設定為40℃，進樣量為50μl[3]。

1.2.2溶液配制 分別精密稱取10mg蘭索拉唑對照品和奧美拉唑的對照品，放在10ml的量瓶中，使用甲醇進行溶解稀釋至其刻度，在搖晃均勻后得到10mg·ml-1的對照品儲備液。精密稱取10mg泮托拉唑放在10ml的量瓶中，使用甲醇進行溶解稀釋至其刻度，在搖晃均勻后得到10mg·ml-1的內標儲備液。

1.2.3線性關系的試驗 精密吸取400μl空白血漿，放入吡美拉唑，使濃度為50，500，4000μg·L-1溶液，進樣后測定色譜峰面積，峰面積定量分析樣品濃度[3]。

1.2.4回收率的試驗 對采集的血漿樣品的峰面積與標準溶液測得的峰面積進行比較，計算提取回收率[4]。

1.2.5精密度的試驗 放入蘭索拉唑和奧美拉唑的50μg·L-1、500μg·L-1、4000μg·L-1濃度不同的樣品中，5次/d進行濃度檢測，連續進行5d檢測。對平均日間精密度進行計算。

1.2.6穩定性的試驗 把血樣放置在冰箱中，分別凍存0h、5h、10h、30d、60d、90d后取出，對穩定性進行觀察。

1.3統計學方法 采用t 檢驗和χ2 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1線性關系 實驗組的線性方程：Y=10.758X+0.006667，相關系數r為0.9998；對照組的線性方程：Y=6.889X-0.000587，相關系數r為0.9999。表明蘭索拉唑和奧美拉唑在0.02μg·mL-1～4.0μg·mL-1的范圍內具有良好的線性關系，蘭索拉唑血藥濃度最低為0.005μg·mL-1奧美拉唑血藥濃度最低為0.0025μg·mL-1 。

2.2回收率 實驗組與對照組的相對回收率比較，見表1。

由表1可見，實驗組的相對回收率為98.15%～102.5%；對照組的相對回收率98.01%～101.15%，兩組比較無顯著性差異，P>0.05，具有可比性。

2.3精密度 實驗組的日內精密度<4%，日間精密度<7%；對照組的日內精密度<5%，日間精密度<6%。

2.4穩定性 蘭索拉唑和奧美拉唑經冷凍溶解檢測，結果RSD 均小于10%。得出蘭索拉唑和奧美拉唑均具有良好的穩定性。

3 討論

反相高效液相色譜法（reversed phase high performance liquid chromatography， RP-HPLC）是一種由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系。這種液相色譜體系和正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC一般采用十八烷基鍵合硅膠作為固定相，采用甲醇和乙腈作為流動相。RP-HPLC是當今液相色譜較為常見的分離模式，這種色譜體系幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離。RP-HPLC一般用于分離非極性或極性較小的化合物。使用RP-HPLC時多種因素可以影響其分離效果，對于非離子型化合物，分子極性越大，其保留值越小；對于同系物分離時，化學鏈越長、苯環越多，其保留值越大。同樣流動相也可以影響被分離組分的保留值，一般而言， 流動相的極性越小， 其保留值越小。比如常用溶劑中水的極性最大，流動相中水的比例減小使得流動相極性下降，組分的保留值也較小。因此為了達到較為理想的分離效果，應該合理選擇流動相。在進行RP-HPLC的實驗操作時，還要注意以下一些細節。①緩沖液使用前需要過濾，實驗結束后對儀器進行清洗以免造成腐蝕和磨損。清洗時先用純凈水沖洗30～60min，沖洗流速約為1ml/min，再使用甲醇沖洗30min。沖洗溶劑不可以選用有機溶劑，否則容易產生細菌或霉菌。②溶劑在使用前都要進行過濾。過濾的目的是除去溶劑中的微小顆粒，避免其堵塞色譜柱。過濾膜應該結合具體分離物質進行合理選擇，一般可以選用水系過濾膜或有機系過濾膜。③溶劑要進行一些前處理才可以上柱，這樣做的目的是除去流動相中溶解或因混合操作而產生的氣泡。混合溶劑容易產生氣泡，因為和單個溶劑相比，混合溶劑可以容納更多的空氣量。RP-HPLC系統流路中存在氣泡時會嚴重影響分離結果。比如可能改變保留時間和峰面積、產生峰變形、產生尖峰和鋸齒狀的噪聲等。 ④分離時可以使用梯度洗脫的方法提高分離效果。在使用梯度洗脫時應該注意溶劑的純度要高，否則重現性較差。梯度混合的溶劑應該有良好的互溶性。應該選擇對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器以提高檢測效果。⑤實驗結束后還要注意對分析柱的適當維護。 使用新柱前可以用強溶劑在低流量下沖洗30min，長時間未用的分析柱也應進行相同處理。不使用時要蓋上塞子避免固定相干枯。同時還要注意對手動進樣器的日常維護以提高液相色譜的使用壽命。

蘭索拉唑屬于一種新型的胃酸分泌抑制藥物，能夠對胃壁細胞-ATP酶進行作用，使胃壁細胞中的H+轉運不到胃中，減少胃液中的胃酸量，在臨床上用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃泌素瘤等疾病，具有較好的療效效果。同時對幽門螺桿菌也具有較好的抑制作用。目前國內有關文獻中報道的測定蘭索拉唑血藥濃度和處理蘭索拉唑血漿樣品的方法上，存在內標物的選擇不夠合理和血漿樣品的處理不夠完全及很難對較低濃度檢測等缺點。本研究采用反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的血藥濃度，具有重現性好和靈敏度高及樣品的預處理較為簡單等一系列特點，可以用于對蘭索拉唑在人體的藥物動力學的研究。

綜上所述，反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的血藥濃度，方法操作簡單，結果準確，靈敏度高，與奧美拉唑比較無顯著性差異，可以用于藥代動力學研究。

參考文獻：

[1]姚文，王曉波，李忠亮，等.高效液相色譜法研究人體內蘭索拉唑片藥動學和生物等效性[J].解放軍藥學學報，2009，25（3）：235-237.

[2]張偉，秦玉花，趙紅衛，等.注射用蘭索拉唑在健康人體內單、多劑量的藥動學研究[J].中國新藥與臨床雜志，2008，27 （2） ：89-93.

[3]鄭志昌，徐春麗.反相高效液相色譜法同時測定血漿中奧美拉唑和蘭索拉唑[J].貴陽醫學院學報，2007，32（3）：262-266.

[4]徐濟萍，彭向前，李軍.奧美拉唑、蘭索拉唑和伴托拉唑對黃嘌呤氧化酶活性的影響[J].中國醫院藥學雜志，2007，27（9）：1190一1192.編輯/許言