α-烯醇化酶重組質粒的構建及其表達形式的研究

摘要：目的 構建α-烯醇化酶（alpha enolase，ENO1）重組表達質粒，并研究其表達形式。方法 以人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）總RNA為模板合成cDNA；根據ENO1基因序列，設計上下游引物，以cDNA為模板，經多聚酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增得到目的基因片段ENO1；用T4DNA連接酶連接酶切產物和原核表達載體pET28(a)，獲得重組表達質粒pET28(a)-ENO1；將pET28(a)-ENO1在BL21(DE3) E.Coli.大腸桿菌中誘導表達，分別取菌液上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，確定重組質粒的表達形式。結果 重組表達質粒pET28(a)-ENO1中的ENO1測序結果與GeneBank上的序列一致；pET28(a)-ENO1以可溶性表達為主。結論 ENO1重組質粒的成功構建及其可溶性為主的表達形式的確定，為研究ENO1的生物學活性及功能奠定了基礎。

關鍵詞：圖書館

Construction and Expression of α-enol Form of the Enzyme in Clinical Study of Recombinant Plasmi

NING Xing-wang1，XIE Xiao-bing1，ZHU Hui-bin1，WANG Shu-xiang1，GE Jin-wen2

(1.Medical Examination Center，The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China;2.Institute of Integrative Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China)

Abstract：ObjectiveTo construct an alpha enolase (ENO1) recombinant expression plasmid， and study its expression form. MethodsThe cDNA was synthesized using total RNA of Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) as the template. ENO1 gene was amplified from cDNA using specific forward and reverse primers by polymerase chain reaction (PCR). The recombinant expression vector was obtained by ligating ENO1 gene and pET28(a) using T4 ligase. ENO1 protein was produced by transfecting expression vector pET28(a)-ENO1 into BL21(DE3) E.Coli. and subsequent IPTG induction. The supernatant and bacteria precipitates were collected and separated by SDS-PAGE electrophoresis， respectively， to determine the expression form of the recombinant plasmid. ResultsThe sequence of cloned gene of ENO1 in the recombinant expression plasmid pET28 (a) - ENO1 was consistent with the sequence from the GeneBank; the expression form of PET28 (a) - ENO1 is soluble expression. ConclusionA kind of recombinant expression vector， pET28 (a) - ENO1， for expressing ENO1 protein was successfully constructed， and its expression form in E.Coli was also confirmed. The studies here will lay the foundation for further research on biological activity and function of ENO1 .

Key words：Alpha enolase; Prokaryotic expression; Recombinant plasmid; Expression formENO1含有434個氨基酸，在結構上高度保守。人體內的ENO1，表達于機體各種組織的內皮細胞中。經多方研究表明[1]，不同系統性血管炎、系統性紅斑狼瘡等諸多自身免疫性疾病患者血清中的抗內皮細胞抗體（anti-endothelial cell antibody，AECA）存在共同的靶抗原，其相對分子質量為47000。經蛋白質組學分析，其成分為ENO1[2]。在體內，AECA與ENO1結合后，通過誘導內皮細胞凋亡、上調粘附分子表達、增加白細胞對內皮細胞的粘附和遷移、增加促炎癥細胞因子和趨化因子的合成和釋放以及細胞毒作用等方式引起內皮細胞損傷和炎癥[3]，但其作用機制尚不十分明確。本研究旨在構建α-烯醇化酶（ENO1）重組表達質粒，并確定其表達形式，為ENO1的生物學活性及功能的進一步研究和AECA作用于靶抗原的機制研究奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料①人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）為湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗中心保存；② pET28(a)質粒以及限制性內切酶Nde I和Xho I購自大連寶生物；③ BL21(DE3) E.Coli.大腸桿菌是一種常用于質?？寺〉木?，購自大連寶生物工程有限公司，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗中心保存。

1.2 主要實驗試劑MCDB131培養基、谷氨酰胺、FBS、內皮細胞生長補充物（ECGS）購自上海鈺森生物科技有限公司；二甲基亞砜和咪唑購自sigma公司；Trizol購自invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自大連寶生物；小提質粒提取試劑盒購自天根生化（北京）科技有限公司；引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

2 方法

2.1 逆轉錄合成cDNA

2.1.1 根據穆楊[4]等的研究方法，采用MCDB131培養基對HUVEC進行傳代培養，培養基中添加2mmol/L谷氨酰胺、20%FBS、50μg/mL肝素和50μg/mL ECGS。于37℃，5%CO2培養箱中培養，待細胞成長到對數生長期；

2.1.2 按Trizol試劑操作說明提取HUVEC總RNA，采用大連寶生物工程有限公司的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行cDNA合成，包含基因組DNA除去反應和逆轉錄反應兩個步驟。

①基因組DNA除去反應見表1。

點動混勻后，于42℃水浴2min，得反應液，放置于4℃冰箱保存。

②逆轉錄反應逆轉錄反應液在冰盒上配置。為保證反應液配制的準確性，進行各項反應時，先按反應數+1的量配制Master Mix（見表2），然后再分裝到每個反應管中。

點動混勻后，經37℃反應15min，85℃反應5sec后，得cDNA合成產物，置于4℃冰箱保存。

2.2 ENO1目的基因的擴增和純化

2.2.1 PCR引物設計及合成根據GenBank中的ENO1基因序列設計引物，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

上游引物P15'CGCCATATGATGTCTATTCTCAAG 3'

下游引物P25'TCTCGAGTGCCCACAGCTTACTTG3'

其中，\"CATATG\"和\"CTCGAG\"分別為Nde I和Xho I的酶切位點。

2.2.2 ENO1目的基因的擴增 以上述逆轉錄所得cDNA合成產物為模板，利用設計的引物進行PCR擴增目的基因ENO1，反應條件見表3。

反應完成后取5μl樣品上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠并進行電泳鑒定，其余放入－20℃冰箱保存備用。

2.3 目的片段ENO1和載體pET28a的連接經切膠純化得到的DNA溶液與載體pET28a經限制性內切酶Nde I和Xho I雙酶切后，利用T4連接酶進行連接，反應產物為重組質粒ENO1-pET28a。連接反應體系見表4。

將連接反應產物上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠并進行電泳鑒定。

2.4 重組質粒ENO1-pET28a的表達與鑒定氯化鈣法制備BL21(DE3) E.Coli.大腸桿菌感受態細胞，將重組質粒ENO1-pET28a進行轉化。采用天根生化（北京）科技有限公司生產的質粒小提中量試劑盒提取轉化后的質粒。按表5重組質粒ENO1-pET28a的酶切鑒定反應體系對提取的重組質粒進行鑒定，將酶切反應產物上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠并進行電泳鑒定。將陽性重組子菌液送大連寶生物工程有限公司測序，進一步驗證重組質粒。

2.5 重組質粒ENO1-pET28a的表達形式分析① 將過夜培養的轉化菌液按照1:50 的比例轉接入1L 新鮮的卡那抗性的LB 培養基中，室溫振蕩培養至對數中期；② 將1L 生長至對數中期的菌液分成兩份，每份各500mL，并向其中一份菌液中加入終濃度為0.1mM 的IPTG，另一份則作為未誘導的對照；③將兩份菌液繼續于室溫振蕩培養4 h；④ 4℃，6000 rpm 離心15min 收集菌體沉淀；⑤按照每克濕重菌體沉淀加入5mL 裂解液，充分重懸菌體沉淀；⑥加入終濃度為0.2mg/mL 的溶菌酶，混勻后冰浴中放置30min；⑦ 冰浴超聲處理5min（工作5s，停5s）；⑧4℃，12，000 rpm 離心20min分離沉淀和上清；⑨將沉淀和上清分別與1×SDS 上樣緩沖液和2×SDS 上樣緩沖液充分混勻，100℃煮沸5min；⑩待樣本冷卻后，進行10%SDS-PAGE分析。

3結果

3.1 通過HUVEC總RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板擴增出ENO1基因序列，大約1305bp。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，與預期結果一致，見圖1。

M：DNA Marker；1：陰性對照；2、3、4：PCR擴增產物

圖1 PCR擴增產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳示意圖

3.2將酶切后的目的片段和pET28a 連接后轉種卡那抗性的固體平板培養基，培養過夜后從平板上挑取8個單克隆菌落，提取質粒后進行酶切鑒定，鑒定結果顯示其中有4個克隆經酶切后出現載體條帶（5，369bp左右）和目的片段條帶（1，305bp左右），即為陽性重組克隆，見圖2。將篩選的陽性重組子送大連寶生物工程有限公司測序，測序結果表明插入序列與數據庫中錄入的ENO1序列匹配。

M：DL15，000 bp marker；1、3和4：陽性重組子；2、5和6：空載體

圖2酶切驗證陽性重組子的1.0%瓊脂糖凝膠電泳示意圖

3.3重組質粒小量表達后，取IPTG誘導表達的菌液離心，分別留取沉淀和上清液進行10% SDS-PAGE電泳分析，同時以未經IPTG誘導的菌液作對照。電泳結果見圖3。經分析可知，重組質粒ENO1-pET28a主要以可溶性表達為主。

M：蛋白分子量Marker；①經IPTG誘導表達后的沉淀；②經IPTG誘導表達后的上清；③未經誘導表達后的沉淀；④未經誘導表達后的上清；箭頭所指為重組質粒目標蛋白。

圖3SDS-PAGE分析重組質粒ENO1-pET28a的表達形式結果示意圖

4 討論

本實驗采用人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）作為總RNA的提取來源，取材簡便，且傳代培養方法成熟。HUVEC 是一種低增殖能力的細胞，對營養成分要求非常高，依照穆楊[9]等的研究，我們采用MCDB131培養基，并且添加ECGS，提高了細胞增殖的效率，有利于HUVEC的貼壁，倒置顯微鏡下顯示，融合效果好。

為了準確地進行基因表達量分析，必須滿足只有cDNA作為模板檢出的先決條件，但總RNA中常?；煊谢蚪MDNA，并可以直接作為PCR反應的模板進行擴增，因此會造成解析結果不準確。本研究采用的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒是可以除去基因組DNA進行RT-PCR反應的專用逆轉錄試劑。試劑盒中使用了具有較強DNA分解活性的gDNA Eraser，通過42℃，2 min即可除去基因組DNA。同時由于反轉錄試劑中含有抑制DNA分解酶活性的組分，經過gDNA Eraser處理后的樣品可以直接進行15 min的逆轉錄反應合成cDNA?？s短了合成反應的時間，對防止RNA降解和cDNA分解起到了良好的作用。

電泳鑒定結果顯示，PCR產物為約1305bp，與預期結果一致。雙酶切后的載體pET28a被切去80bp，成線形，而未被酶切的載體成超螺旋狀態，經過電泳，成超螺旋狀態的未酶切的pET28a泳動速度較快。應用T4連接酶將酶切后的ENO1基因與酶切后的載體pET28a進行連接，陽性重組子經過酶切鑒定，重組子包含目標基因大小片段和載體大小片段，經過測序鑒定，重組子內包含與ENO1一致的序列。本實驗通過逆轉錄成功制備ENO1-pET28a重組質粒，為后續研究打下基礎。

重組質粒ENO1-pET28a經過IPTG誘導表達后，蛋白含量明顯增加；SDS-PAGE顯示上清液有一明顯的分子量大小約為47000的條帶出現，而沉淀中該區域含蛋白量很低，甚至缺如，因此，我們判斷重組質粒ENO1-pET28a以可溶性表達為主。

總之，經Nde I和Xho I雙酶切和測序鑒定，本研究成果構建了重組質粒pET28(a)-ENO1，經IPTG誘導后高效表達，且確定了重組質粒以可溶性表達為主，為進一步研究ENO1與AECA的作用機制奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 郭紫芬，陳成立，周翠蘭，等. 抗人血管內皮細胞膜蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國動脈硬化雜志，2008，16（9）：685-688.

[2] Wegner N，Lundberg K，Kinloch A， et al． Autoimmunity to specific citrullinated proteins gives the first clues to the etiology of rheumatoid arthritis［J］． Immunol Rev，2010，233( 1) : 34-54．

[3] Belizna C，Duijvestijn A，Hamidou M，et al. Antiendothelial cell antibodies in vasculitis and connective tissue disease[J]. Ann Rheum Dis，2006，65:1545-1550.

[4] 穆楊，叢日華，張彥明. 人大血管內皮細胞培養條件的完善[J]. 動物醫學進展，2002，23（1）：82-84.

編輯/王海靜投稿小知識計量單位 文章中的年月日及各種數字一律用阿拉伯數字表示。計量單位采用1984年頒布的《中華人民共和國法定計量單位》，并用符號表示。如：m（米）、cm（厘米）、mm（毫米）、t（噸）、kg（千克）、g（克）、mg（毫克）、μg（微克）、kg/m2（千克/米2）、L（升）、ml（毫升）、d（天）、h（小時）、min（分種）、s（秒）、hm2（公頃）。