Chk2蛋白激酶生物學功能研究進展

摘要：Checkpoint kinase 2 (Chk2)是一種多功能蛋白激酶，不僅在DNA損傷誘導的細胞周期阻滯、DNA修復和細胞凋亡過程中扮演著重要角色，而且最新研究發現，其在有絲分裂過程中對紡錘體的組裝和染色體穩定性的維持也是必須的。越來越多的證據顯示，Chk2和人類腫瘤存在著密切關系，其被視為腫瘤治療新的分子靶標，在抑制人類腫瘤發生發展中起著關鍵作用。本文就Chk2蛋白激酶的主要生物學功能作一綜述。

關鍵詞：檢查點激酶2；生物學功能

Research Progression of Biological Function of Chk2 Protein Kinase

LI Ao-hang

(Clinical Examination Center，Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China)

Abstract：Checkpoint kinase 2 (Chk2) isa multifunctional enzyme whose functions are central to the induction of cell cycle arrest，DNA repair and apoptosis by DNA damage.In addition，most recent work has revealed another function of Chk2，independent of DNA damage，that is required for the proper mitotic spindle assembly and for the maintenance of chromosomal stability.The relationship of Chk2 to human cancer studies are developing rapidlywith increasing evidence that Chk2 plays a vital role in tumor suppression and will be viewed as a new anti-cancer therapy molecular target.The research progression of biological function of Chk2 protein kinase is reviewed in this article.

Key words：Chk2；Biological function1引言

Checkpoint kinase 2 (Chk2，又被稱作hCds1或Chek2) 是一種多功能蛋白激酶，作為腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中發現其發生突變，包括肝癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和結腸癌等[1，2]。Chk2作為DNA損傷應答信號通路中的重要一員，在DNA損傷反應中發揮著重要作用。DNA損傷發生后，啟動信號級聯反應，Chk2被上游的磷脂酰肌醇3-激酶相關蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase，PIKK)家族中的成員如毛細血管共濟失調突變基因(ataxia telangiectasia mutated gene，ATM)、毛細血管共濟失調和Rad3相關基因(ataxia telangiectasia and Rad3 related，ATR)和DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)等[3]磷酸化后，激活的Chk2激酶扮演著信號轉導器的作用，磷酸化多種底物如Cdc25、p53、PML、E2F1和BRCA1等，進一步誘導DNA損傷后的細胞學事件如細胞周期阻滯、DNA修復和細胞凋亡等的發生。然而，Chk2缺陷的胚胎細胞對電離輻射導致的細胞周期阻滯、DNA修復和凋亡等失調控[4，5]。Chk2除在DNA損傷反應中發揮重要作用外，近年的研究又發現Chk2在維持正常有絲分裂進程和染色體穩定性方面也發揮著關鍵作用[6]。在正常人體細胞中，Chk2的缺失或其激酶活性的鈍化，將導致有絲分裂進程延遲、相關的紡錘體組裝異常和染色體的不穩定性發生，然而細胞卻仍然存活并增殖。越來越多的證據顯示，Chk2 對DNA損傷反應和有絲分裂進程的調控，最終決定了其腫瘤抑制基因的角色。

2 Chk2的結構特點

人類Chk2基因位于染色體22q12.1，大約含有50 kb，包含14個外顯子(圖1A)[7]。Chk2蛋白主要含有三個功能結構域：絲氨酸-谷氨酰胺/蘇氨酸-谷氨酰胺氨基酸對富含區(SQ/TQ cluster domain，SCD)、FHA區(Forkhead-associated domain) 和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性區(Kinase domain)，三個結構域對于其激酶活性的發揮都是必不可少(圖1 B)[1，8，9]。SCD 結構域中的Thr68位點可被PIKK家族激酶磷酸化，磷酸化的Thr68通過構象改變促進了激酶活性區活化環內的Thr383和Thr387的磷酸化，從而啟動Chk2激酶的自身磷酸化過程。在眾多的磷酸化位點中，Thr68位點的磷酸化對于Chk2的活性是必不可少的，Thr68位點的磷酸化水平也能反映出Chk2的激酶活性[10-12]。經典的FHA結構域包含大約55~75個氨基酸和三個高度保守區域[13]，FHA結構域包含400種以上蛋白質，包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶、轉錄因子和其他信號蛋白等[14]，其結合磷酸化底物并被視為蛋白質相互作用的調節模塊[15]，FHA結構域的遺傳性突變和非p53依賴的李弗勞明綜合征(Li-Fraumeni syndromes)有關[16，17]，FHA結構域中的突變體I157T破壞了Chk2的低聚反應[18]。激酶活性區包含一個環繞著Thr383和Thr387的活化環，激酶活化需要活化環的空間構象發生改變[9]。另外，該區域中的兩個突變體D347A和D368N會導致Chk2激酶失活[18，19]。除了對Chk2活性極為關鍵的Thr68位點外，對于其他一些磷酸化位點在調控Chk2活性中的作用也正在被逐漸揭示，如Ser456位點磷酸化的作用是調節DNA損傷反應中Chk2穩定性的[20]，而Ser516位點磷酸化的作用是調節輻射誘導的凋亡過程的[21]。

3 Chk2的生物學功能

在人類細胞中，蛋白激酶Chk2具有多種生物學功能，這些功能的發揮對于DNA損傷反應、有絲分裂進程和染色體穩定性的維持都至關重要，并最終決定細胞的命運。

3.1 Chk2與DNA損傷反應為了維持真核細胞基因組的穩定性，細胞進化了一套應對基因組損傷時會被激活的信號通路。這些被稱為檢查點的通路負責使細胞周期發生阻滯以便為DNA修復提供時間，如果損傷不能被修復就會觸發凋亡[22]。然而，基因組損傷修復的失敗必然會導致基因組異常的積累，而這又與腫瘤形成密切相關。檢查點激酶Chk2以及與之結構不同但功能相似的Chk1激酶在DNA損傷檢查點通路中扮演著關鍵角色[23]。

Chk2 和Chk1激酶主要被PIKK家族激酶ATM、DNA-PKcs和ATR磷酸化從而被激活，這些激酶通過DNA損傷感應復合物MRN (Mre1-Rad50-Nbs1)和ATRIP (ATR- interacting protein)等使DNA斷裂鏈得以修復。取決于DNA損傷類型的不同，DNA單鏈發生斷裂后，主要是ATR磷酸化并激活Chk1發揮作用；DNA雙鏈發生斷裂后，主要是ATM和DNA-PKcs磷酸化并激活Chk2發揮作用。Chk2 Thr68位點的磷酸化作用，激活了激酶活性區活化環上Thr383和Thr387的自磷酸化，Thr68位點的磷酸化對Chk2 激酶活性的發揮至關重要[1，24]。

3.2 Chk2與細胞周期阻滯Chk2一旦被激活，就可以磷酸化幾個關鍵的作用底物包括Cdc25C（Ser216位點），Cdc25A（Ser123，Ser178，Ser292位點），p53（Ser20位點），BRCA1（Ser988位點），PML（Ser117位點）和E2F1（Ser364位點），這些底物在DNA損傷反應中對調控細胞周期阻滯、DNA修復和細胞凋亡是必不可少的[1，24，25]。Chk2使Cdc25C Ser216位點發生磷酸化，這促進了它與14-3-3蛋白的結合，并使其從細胞核轉移至細胞質。由于Cdc25C對細胞G2/M交界期CDK1的激活是必需的，所以Cdc25C的離開將導致細胞周期阻滯在G2期，從而阻止細胞在DNA損傷未修復的情況下進入有絲分裂期[25]。類似的，Chk2通過磷酸化CDK2相關的Cdc25A使細胞周期阻滯在G1期，在此過程中Chk2使Cdc25A的Ser123、Ser178和Ser292位點發生磷酸化，這促進了它與SCFβ-TrCP遍在蛋白連接酶復合體的結合，并導致蛋白酶的降解以防止G1/S交界期CDK2的激活[26]。

抑癌基因p53是DNA損傷反應中Chk2的一個關鍵靶標，事實上，基因敲出小鼠實驗已經證明了DNA損傷后Chk2可使p53的Ser20位點發生磷酸化，同時這種磷酸化作用可阻止p53與MDM2的相互作用，從而保證了p53的穩定和累積[27，28]。因此，Chk2是p53的直接調節器并介導p53依賴的細胞周期阻滯和凋亡。然而，也有一些使用基因敲除小鼠或Chk2缺陷的人類細胞系研究揭示Chk2對DNA損傷后的p53穩定性的影響不是必需的[29-31]。

3.3 Chk2與DNA修復在人類細胞中，Chk2 在DNA修復中通過磷酸化和調節BRCA1而發揮作用。DNA損傷發生后，Chk2使BRCA1的Ser988位點發生磷酸化，從而使其從核的foci斷裂處分離下。這種游離且被激活的BRCA1然后調節無差錯的同源重組(homologous recombination， HR)修復途徑，而不是非同源末端連接(non-homologous end joining， NHEJ) 修復途徑[32，33]。此途徑通過BRCA1 和BRCA2復合物以及DNA修復的一個關鍵因子Rad51復合酶促進DNA修復[34，35]。可以推測，通過Chk2調控BRCA1從而加速了修復從NHEJ途徑向HR途徑的轉變[32]。然而，這個通路僅在G2期和M期DNA復制和姐妹染色單體合成時發揮作用。有趣的是，BRCA1也和DNA錯配修復蛋白例如Msh2-Msh6-complex有關聯[36]，Chk2也與Msh2有關聯[37]，但Chk2和BRCA1是否也參與到DNA錯配修復中仍不明確。

3.4 Chk2與凋亡當DNA損傷不能被修復時，損傷的細胞會開始凋亡，這也是受Chk2激酶調控的。事實上，Chk2對于p53依賴的凋亡的誘發是必需的，而且，Chk2可能也是通過使轉錄因子E2F1的Ser364位點發生磷酸化，來促進p53依賴的凋亡的[38]。同時，Chk2也能使抑癌基因PML的Ser117位點發生磷酸化，從而促進p53非依賴途徑的凋亡[39]。

3.5 Chk2與染色體穩定性Chk2參與DNA損傷的角色得到確定后，其參與有絲分裂期染色體穩定性的角色也得到了驗證。基于染色體的不穩定性即染色體的持續獲得或缺失作為人類腫瘤的一個主要特點，直接關系到腫瘤的發生和發展[6]，所以Chk2在此過程中扮演的角色顯得十分重要。在人體細胞中，Chk2的缺失或其激酶活性的抑制足以誘導染色體的不穩定性(chromosomal instability， CIN)，且該功能是不依賴于p53的[6]。因此，把Chk2放入人類腫瘤中與CIN相關的少數幾個基因集團中。因此，Chk2作為一個重要的抑癌基因，參與到有絲分裂紡錘體的及時裝配中，關系著染色體準確連接到有絲分裂紡錘體上以及隨后姐妹染色單體正確的分配到兩個子細胞中，維持著染色體的穩定性。

有意思的是，抑癌基因BRCA1作為Chk2的直接作用底物，其Ser988位點的磷酸化不僅發生在DNA損傷后，也發生在有絲分裂期。然而，BRCA1有絲分裂期的磷酸化作用又調控著Chk2在有絲分裂期的作用。實際上，BRCA1的缺失或Chk2介導的磷酸化作用的異常都會導致有絲分裂紡錘體裝配的錯誤并在人體細胞中誘發CIN[6]。推測BRCA1可能定位在有絲分裂中心體上，通過調控γ-tubulin遍在蛋白化作用來調節中心體的完整性和紡錘體的裝配[40，41]。

3.6 Chk2與癌癥眾多研究表明，Chk2作為多種腫瘤的易感基因，而且Chk2的缺失集中在染色體的22q13位置，這在乳腺癌、結腸癌、卵巢癌和腦癌中已經被報道。而且研究發現在大多數人類肺癌中Chk2是缺失的[1，6，42]。

鑒于Chk2在有絲分裂紡錘體形成中的新功能，推測作用于微管的抑制有絲分裂的藥物可能在腫瘤細胞中與Chk2的缺失發揮著協同作用，這些用于腫瘤治療的常用藥物包括taxanes、epothilones 和Vinca alkaloids等[43]。這些藥物是否對Chk2缺失腫瘤細胞抑制有絲分裂紡錘體的形成具有增強作用值得進一步研究。

4結語和展望

近年來，關于Chk2的研究取得了一定的進展，未來Chk2的研究可能主要集中在鑒定新的作用底物、相互作用蛋白以及對發揮其功能起重要作用的磷酸化作用位點等方面，隨著描繪Chk2功能的藍圖逐漸變得清晰，關于Chk2如何集中發揮它的多種功能，從而精確的誘導檢查點激活作用并導向某種生物學后果將變得十分有意義。進一步弄清Chk2 和p53的關系也是十分重要的。Chk2在DNA損傷反應和有絲分裂調控中的作用，決定著細胞最終的命運。因此，對Chk2活性調控的深入研究將給未來腫瘤的治療提供更多新的思路和手段。

參考文獻:

[1]Antoni L，Sodha N，Collins I，et al.CHK2 kinase:cancer susceptibility and cancer therapy-two sides of the same coin[J].Nat Rev Nat Rev Cancer，2007，7(12):925-936.

[2]Bartek J，Lukas J.Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer[J].Cancer Cell，2003，3(5):421-429.

[3]Downs J A，Nussenzweig M C，Nussenzweig A.Chromatin dynamics and the preservation of genetic information[J].Nature，2007，447(7147):951-958.

[4]Hirao A，Kong Y Y，Matsuoka S，et al.DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2[J].Science，2000，287(5459):1824-1827.

[5]Lee J S，Collins K M，Brown A L，et al.hCds1-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response[J].Nature，2000，404(6774):201-204.

[6]Stolz A，Ertych N，Kienitz A，et al.The CHK2-BRCA1 tumour suppressor pathway ensures chromosomal stability in human somatic cells[J].]Nat Cell Biol，2010，12(5):492-499.

[7] Bartek J， Falck J， Lukas J. CHK2 kinase-a busy messenger[J].Nat Rev Mol Cell Biol， 2001， 2(12):877-886.

[8]Pommier Y，Sordet O，Rao V A，et al.Targeting Chk2 Kinase:Molecular Interaction Maps and Therapeutic Rationale[J].Curr Pharm Des，2005，11(22):2855-2872.

[9]Oliver A W，Paul A，Boxall K J，et al.Trans-activation of the DNA-damage signaling protein kinase Chk2 by T-loop exchange[J].EMBO J，2006，25(13):3179-3190.

[10]Ahn J Y，Schwarz J K，Piwnica-Worms H，et al.Threonine 68 phosphorylation by ataxia telangiectasia mutated is required for efficient activation of Chk2 in response to ionizing radiation[J].Cancer Res，2000，60(21):5934-5936.

[11]Melchionna R，Chen X B，Blasina A，et al.Threonine 68 is required for radiation-induced phosphorylation and activation of Cds1[J].Nat Cell Biol，2000，2(10):762-765.

[12]Matsuoka S，Rotman G，Ogawa A，et al.Ataxia telangiectasia-mutated phosphorylates chk2 in vivo and in vitro[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(19):10389-10394.

[13]Hofmann K，Bucher P.The FHA domain:a putative nuclear signalling domain found in protein kinases and transcription factors[J].Trends Biochem Sci，1995，20(9):347-349.

[14]Qin D，Lee H，Yuan C，et al.Identi?cation of potential binding sites for the FHA domain of human Chk2 by in vitro binding studies[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，311(4):803-808.

[15]Durocher D，Taylor I A，Sarbassova D，et al.The molecular basis of FHA domain:phosphopeptide binding speci?city and implications for phospho-dependent signaling mechanisms[J].Mol Cell，2000，6(5):1169-1182.

[16] Li J， Williams B L， Haire L F， et al. Structural and functional versatility of the FHA domain in DNA-damage signaling by the tumor suppressor kinase Chk2 [J].Mol Cell， 2002， 9(5):1045-1054.

[17]Bell D W，Varley J M，Szydlo T E，et al.Heterozygous germ line hCHK2 mutations in Li-Fraumeni syndrome[J].Science，1999，286(5449):2528-2531.

[18]Schwarz J K，Lovly C M，Piwnica-Worms H. Regulation of the Chk2 Protein Kinase by Oligomerization-Mediated cis- and trans-Phosphorylation[J].Mol Cancer Res，2003，1(8):598-609.

[19]Matsuoka S，Huang M，Elledge S J.Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase[J].Science，1998，282(5395):1893-1897.

[20]Kass E M，Ahn J，Tanaka T，et al.Stability of checkpoint kinase 2 is regulated via phosphorylation at serine 456[J].J Biol Chem，2007，82(41):30311-30321.

[21]Wu X，Chen J.Autophosphorylation of checkpoint kinase 2 at serine 516 is required for radiation-induced apoptosis[J]J Biol Chem，2003，278(38):36163-36168.

[22]Kastan M B，Bartek J.Cell-cycle checkpoints and cancer[J]Nature，2004，432(7015):316-323

[23]Bartek J，Lukas J.Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer[J].Cancer Cell，2003，3(5):421-429.

[24]Ahn J，Urist M，Prives C.The Chk2 protein kinase[J].DNA Repair (Amst)，2004，3(8-9):1039-1047.

[25]Blasina A，de Weyer I V，Laus M C，et al.A human homologue of the checkpoint kinase Cds1 directly inhibits Cdc25 phosphatase[J].Curr Biol，1999，9(1):1-10.

[26]Falck J，Mailand N，Syljuasen R G，et al.The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis[J].Nature，2001，410 (6830):842-847.

[27]Chehab N H，Malikzay A，Appel M，et al.Chk2/hCds1 functions as a DNA damage checkpoint in G(1) by stabilizing p53[J].Genes Dev，2000，14(3):278-288.

[28]Shieh S Y，Ahn J，Tamai K，et al.The human homologs of checkpoint kinases Chk1 and Cds1 (Chk2) phosphorylate p53 at multiple DNA damage-inducible sites [J].Genes Dev，2000，14(3):289-300.

[29]Jallepalli P V，Lengauer C，Vogelstein B，et al.The Chk2 tumor suppressor is not required for p53 responses in human cancer cells[J].J Biol Chem，2003，278(23):20475-20479.

[30]Jack M T，Woo R A，Hirao A，et al.Chk2 is dispensable for p53-mediated G1 arrest but is required for a latent p53-mediated apoptotic response[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(15):9825-9829.

[31]Ahn J，Urist M，Prives C.Questioning the role of checkpoint kinase 2 in the p53 DNA damage response[J].J Biol Chem，2003，278(23):20480-20489.

[32]Zhang J，Willers H，Feng Z，et al.Chk2 phosphorylation of BRCA1 regulates DNA double-strand break repair[J].Mol Cell Biol，2004，24(2):708-718.

[33]Zhuang J，Zhang J，Willers H，et al.Checkpoint kinase 2-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the fidelity of nonhomologous end-joining[J].Cancer Res，2006，66(3):1401-1408.

[34]Scully R，Chen J，Plug A，et al.Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells[J].Cell，1997，88(2):265-275.

[35]Xia F，Taghian D G，DeFrank J S，et al.Deficiency of human BRCA2 leads to impaired homologous recombination but maintains normal nonhomologous end joining[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(15):8644-8649.

[36]Wang Q，Zhang H，Guerrette S，et al.Adenosine nucleotide modulates the physical interaction between hMSH2 and BRCA1[J].Oncogene，2001，20(34):4640-4649.

[37]Brown K D，Rathi A，Kamath R，et al.The mismatch repair system is required for S-phase checkpoint activation[J].Nat Genet，2003，33(1):80-84.

[38]Stevens C，Smith L，La Thangue N B.Chk2 activates E2F-1 in response to DNA damage [J].Nat Cell Biol，2003，5(5):401-409.

[39]Yang S，Kuo C，Bisi J E，et al.PML-dependent apoptosis after DNA damage is regulated by the checkpoint kinase hCds1/Chk2[J].Nat Cell Biol，2002，4(11):865-870.

[40]Kais Z，Parvin J D.Regulation of centrosomes by the BRCA1-dependent ubiquitin ligase[J].Cancer Biol Ther，2008，7(10):1540-1543.

[41]Joukov V，Groen A C，Prokhorova T，et al.The BRCA1/BARD1 heterodimer modulates ran-dependent mitotic spindle assembly[J].Cell，2006，127(3):539-552.

[42]Perona R，Moncho-Amor V，Machado-Pinilla R，et al.Role of CHK2 in cancer development[J].Clin Transl Oncol，2008，10(9):538-542.

[43]Kaestner P，Bastians H.Mitotic drug targets[J].J Cell Biochem，2010，111(2):258-265.

編輯/申磊