比較不同培養基培養臍帶間充質干細胞

摘要：目前的培養體系和培養方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培養基，但含血清培養基使臨床細胞治療受到限制，存在不安全因素。通過對臍帶間充質干細胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚紅）及無血清培養基StemProRMSC SFM的培養擴增，比較三種培養體系的優略。建立從減血清到無血清的培養體系，減少血清對臨床細胞治療的干擾，提高臨床細胞治療的穩定性與安全性。

關鍵詞：有血清培養基;無血清培養基;臍帶間充質干細胞隨著對臍帶間充質干細胞生物學特性及功能的深入研究，臍帶間充質干細胞可在體外大量培養擴增，且生物性能穩定，多次傳代擴增仍能保持旺盛的功能。同時臍帶間充質干細胞還具有取材方便，無倫理學限制，免疫原性相對純凈的優勢，可以為實驗和臨床提供足夠的細胞來源。

1資料與方法

1.1一般資料經產婦知情同意，采集足月剖宮產健康胎兒臍帶，無菌情況下放入含有抗生素的生理鹽水中，4℃保存，6h內無菌處理。

1.2臍帶的分離和原代培養植塊法分離臍帶：用止血鉗及剪刀無菌取胎兒臍帶4~5cm，D-hank's液充分洗滌，去除臍靜脈及動脈內的新鮮血液，分離并去除臍帶外膜組織和血管組織，獲得臍帶wharton膠。將其剪碎至1mm3組織塊，使用吸管將組織塊逐一植入T75培養瓶底，密度20~25塊/瓶為宜，組織小塊在瓶底要分布均勻，倒置放入37℃，體積分數為5%CO2飽和濕度培養箱內。3~5h后待組織塊粘附牢固正向放置到超凈臺內，加入適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，正向放入體積分數為5%CO2飽和濕度培養箱內。72h后換液，一般5~7d可有間充質干細胞爬出。

1.3臍帶間充質干細胞在不同培養體系的體外擴增將原代細胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚紅）、StemProR MSC SFM三種培養體系中傳代培養，在生長過程中進行形態學觀察。

1.4 流式細胞儀表型檢測取生長狀態良好的P4代細胞，消化并計數，以每管1×106個細胞，分別加入10μl單克隆抗體CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及陰性對照 lgG1-PE、陽性對照lgG1-FITC，室溫避光孵育30min，PBS洗滌兩次，室溫300g，5min。PBS重懸后上流式細胞儀。

1.5 cck-8 法檢測細胞活性取生長狀態良好的P4代細胞，調整細胞濃度至0.2×105/ml，加入96孔板。每孔90μl放在37℃、體積分數為5%CO2飽和濕度培養箱內培養。7d內每日上午10:00取出96孔板用與原來孔內相同培養基100μl換液后加入cck-8溶液，繼續孵育1h。用酶標儀波長450nm測定各孔OD值。以OD值代表細胞的相對數量，繪制細胞生長曲線。

2結果

2.1細胞形態學觀察在細胞植塊5~7d可見呈纖維樣細胞從植塊邊緣爬出，散在分布或形成小克隆。2~3w細胞達到70%左右融合，細胞呈平行或旋渦狀排列。下圖為傳代培養至P2代細胞，1d后觀察無血清培養基StemProRMSC SFM和有血清DMEM/F12中臍帶間充質干細胞的生長狀態。

2.2流式細胞表型特征流式細胞學檢測顯示，三種培養體系中人臍帶間充質干細胞均不表達造血干細胞標記CD34、CD45、HLA-DR、高表達CD73、CD105、HLA-ABC。

2.3 hUC-MSCs在三種培養體系的生長曲線，見圖3。

圖3 hUC-MSCs在三種培養體系的生長曲線

3三種培養體系的比較

3.1 DMEM/F12培養基（不含酚紅）早期實驗室廣泛應用的是Eearle's MEM即最低必需培養基。它是建立在平衡鹽溶液（BSS）基礎上的，它僅含有12種必須氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素。成分簡單，可用于哺乳動物細胞類型的培養。DMEM與最低必需培養基相比，氨基酸含量為MEM的2倍，又添加了甘氨酸、絲氨酸等非必需氨基酸；維生素含量為MEM的四倍，同時含有酵解途徑中的重要物質-丙酮酸和微量的鐵離子。而Ham's F12培養基成分復雜，含有多種微量元素，可加入少量血清培養，特別適合于克隆細胞的培養。

臍帶間充質干細胞的培養大多使用的是DMEM/F12，它將含有較豐富成分的F12和高濃度營養成分的DMEM 1:1結合，配制成DMEM/F12培養基。考慮到DMEM/F12可作為無血清培養基的基礎，且適用于血清濃度含量較低條件下哺乳動物的細胞培養，故本實驗使用DMEM/F12進行原代細胞的培養，為傳代擴增更好的適應另兩種培養體系做好基礎。

本實驗選用不含酚紅的DMEM/F12。由于酚紅是一種實驗診斷藥，在常用的DMEM/F12培養基中被用作PH值的指示劑。中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。它在無血清培養基中會引起鈉/鉀失衡，影響細胞生長；在一些雌激素的研究表明，酚紅可以模擬固醇類雌激素作用[1]，產生固醇類反應。而且在后期細胞檢測中酚紅對流式細胞檢測會產生干擾，因此本實驗選擇了不含酚紅的培養基進行原代間充質干細胞培養。

3.2 IMDM 培養基IMDM(Iscove's Modified Dubecco's Medium ) 又稱為伊思柯夫改良培養液。此種培養基含有硒、額外的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉和HEPES，并用硝酸鉀取代了硝酸鐵；不含α-硫代甘油；不含碳酸氫鈉；含酚紅。IMDM適合高密度細胞培養，適用于成纖維細胞培養，一般加入的血清濃度為20%。

3.3無血清培養基StemProRMSC SFM無血清培養基就是在細胞培養中不添加血清的成分，但要添加替代血清成分的補充因子。①必需補充因子：胰島素、轉鐵蛋白和亞硒酸鈉。胰島素可以促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，是重要的細胞存活因子[2]。大多數哺乳動物細胞上存在特定的轉鐵蛋白受體與轉鐵蛋白/Fe3+復合物結合是細胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源。微量元素硒參與谷胱甘肽過氧化物歧化酶的作用過程，消除氧化物酶和氧自由基對細胞的傷害。②特殊補充因子：生長因子和激素[3]。生長因子包括表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和神經生長因子等。③激素除了胰島素外，大多數的哺乳動物細胞還需要一定量的其它激素如甲狀腺素、多肽類激素中的生長激素等。

3.4三種培養體系的比較通過細胞生長曲線我們明顯看出在含血清培養基中臍帶間充質干細胞在DMEM/F12中的生長狀態要明顯高于IMDM，同時考慮到IMDM所需的血清濃度高，且含有酚紅，不利于后續操作中進行減血清到無血清的培養擴增及流式檢測。因此，實際比較的是DMEM/F12和StemProRMSC SFM兩種培養體系。不可否認血清成分多樣，對細胞生長有很大的促進作用。但同樣存在著一些風險：①取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響。②血清中含有一些對細胞有毒性的物質，如多氨氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應，形成有細胞毒性作用的聚精胺。③血清的使用使得實驗室和生產的標準化很難達到，尤其在臨床細胞治療中存在很大的風險性。④批間差異。上述情況看來無血清培養基是目前實驗室培養細胞用培養基的首選，但在臍帶間充質干細胞種子細胞的培養中無血清培養基仍不能替代有血清培養基。因此，采用無血清培養最關鍵的問題是細胞從有血清培養基到無血清培養基的馴化過程。

4從有血清培養基到無血清培養基的馴化

按照細胞對無血清培養基的適應性可將培養方法分為直接適應法和連續適應法。直接適應法即細胞從添加血清的培養基直接轉換到無血清培養基中；連續適應法即分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基中，與直接適應法相比，連續適應對細胞更加溫和。本次試驗將含10%血清的DMEM/F12直接傳代至StemProRMSC SFM，通過圖3三條不同的生長曲線細胞對比顯示StemProRMSC SFM生長和增殖都較慢，證明間充質干細胞轉入到無血清培養基中需要一個適應性的過程，更適合于連續培養法，將血清濃度從10%逐步減少到5%，3%，1%直到無血清培養。同時，無血清培養基對細胞的要求較高：必須是對數生長期的細胞，且活率不應低于90%，適應后應該以較高的起始細胞接種；在培養過程中應該對上一代的混合培養物備份，直到細胞適應新的混合培養基。此外，在適應過程中，不要讓細胞過度生長，這樣將增加細胞選擇亞群的可能性；需要注意的是無血清培養基中含有非常少的蛋白質，更易于受外界因素的影響。間充質干細胞從有血清培養基到無血清培養基馴化的過程不僅僅是簡單的降血清培養，還有很多需要探索的影響細胞生長的因素。

參考文獻：

[1]Bethois Y，Katzenellenbogen JA，Katzenellenbogen BS. Phenolred in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture[J]. ProcNalt Acad SCI USA，1986，83(8):2496-2500.

[2]林世康，胡云龍，施國民.動物細胞無血清培養基的應用及研究發展[J].細胞生物學雜志，2000，22（3）:154-157.

[3]Gassy MC， Tharakan JP，Chau PC.Serum-free media in hybriddo-ma culture and monocleonal antibody production[J].Biotech ＆Bioeng， 1998，32:1015-1028.

編輯/申磊