雷公藤多苷對ACD小鼠體外培養T淋巴細胞亞群影響

摘要：目的探討雷公藤多苷對體外培養的變應性接觸性皮炎（ACD）小鼠T淋巴細胞亞群影響。方法以2，4-二硝氯苯（DNCB）制作ACD小鼠模型，分離淋巴細胞，各濃度雷公藤多苷體外作用48h后，利用流式細胞儀檢測CD3+T，CD4+T，CD8+T細胞數量。結果雷公藤多苷可以顯著抑制Th（CD4+T）細胞的表達（P＜0.01），高低濃度比較差異具有顯著性（P＜0.01），高中濃度組間、中低濃度組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。雷公藤多苷可以降低ACD小鼠體外培養的Tc淋巴細胞（CD8+T）數量，抑制Tc細胞的表達。雷公藤多苷高濃度可以降低ACD小鼠體外培養的CD3+淋巴細胞數量，抑制CD3+細胞的表達（P＜0.01）。結論雷公藤多苷可以減少成熟T淋巴細胞表達，非特異性地降低Ⅳ型變態反應主要效應細胞CD4+T及CD8+T亞群的表達，可能是雷公藤多苷治療ACD的免疫抑制機理之一。

關鍵詞：雷公藤多苷；變應性接觸性皮炎；T細胞亞群雷公藤是衛矛科雷公藤屬的木質藤本植物，最早收載于《神農本草經》，味苦，辛涼，有大毒，氣味特異，其藥用部位主要為根及根莖。雷公藤成分復雜，雷公藤多甙(又稱：雷公藤總甙)是目前臨床應用的最廣泛的雷公藤制劑之一，是雷公藤根芯部分用水和氯仿提取，經柱色譜分離得到的一種有效組分[1]，其生物活性是由多種成分(二萜內酯、生物堿、三萜等)協同產生。本項目擬通過實驗探討雷公藤多苷對變應性接觸性皮炎(ACD)小鼠體外培養T淋巴細胞亞群影響。

1器材

1.1動物6~8w齡昆明鼠，雄性，購自天津醫科大學動物實驗中心。

1.2儀器超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），CO2培養箱（Thermo公司，德國）；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)；臺式高速離心機(北京醫用離心機廠，日本)；流 式 細 胞 儀(FACSCalibur型美國BD公司，美國)，

1.3試劑RPMI-1640培養液（Gibco公司），胎牛血清（中國醫學科學院血液病研究所），2，4-二硝氯苯（1-chloro-2:4-dinitrobenzene，DNCB）（天津市化學試劑公司），PE anti-mouse CD8（PE標記抗鼠CD8熒光抗體）；PE anti-mouse CD4（PE標記抗鼠CD4熒光抗體）；FITC anti-mouse CD3（FITC標記抗鼠CD3熒光抗體），雷公藤多苷購自浙江得恩德制藥有限公司。

2方法

2.1 ACD小鼠模型制備剪除小鼠背部3cm2鼠毛，涂抹5%DNCB；10d后，小鼠耳廓內外兩側涂抹1% DNCB。1w后激發一次，重復四次。第四次激發后24h后觀察皮損狀況，并取背部及耳部皮膚組織病理檢查。HE染色后，觀察炎性細胞浸潤，表皮細胞間水腫、細胞內水腫，網狀變性、表皮壞死，確定模型成功。

2.2 ACD小鼠淋巴細胞分離培養小鼠頸椎脫位處死無菌取脾臟，研磨脾臟，收集脾細胞懸液，離心懸浮細胞，計數，調整為濃度2×106/mL，然后平均分為4組，分別加入含有藥物的RPMI-1640培養液（藥物濃度分別為雷公藤多苷0，1，2，4μmol/L)，每組一式3孔。混勻后放入含有5%CO2的CO2溫箱內，37℃，培養48h后進行檢測。

2.3雷公藤對體外培養小鼠T淋巴細胞亞群影響的檢測吸取細胞， 離心，棄上清液， PBS重懸細胞入流式試管中，離心，棄上清，洗滌細胞，吸棄上清；每管分別加入5μL FITC anti-mouse CD3、5μL PE anti-mouse CD4和5μL FITC anti-mouse CD3、10μL PE anti-mouse CD8；震蕩，室溫避光保存30min；加入500μL 4%多聚甲醛，應用流式細胞儀檢測，經488nm激光激發，依CellQuest軟件，每個樣本取10000個細胞。

2.4統計學方法實驗數據經SPSS11.0軟件處理，多組間兩兩比較采取單因素方差分析。

3結果

見表1，表2，表3。

雷公藤多苷可以抑制Th細胞的表達。雷公藤多苷各濃度組體均可以顯著降低體外培養的ACD小鼠Th淋巴細胞含量（P＜0.01），高濃度組與低濃度比較差異具有顯著性（P＜0.01），高濃度組與中濃度組、中濃度組與低濃度組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

雷公藤多苷可以降低ACD小鼠體外培養的Tc淋巴細胞數量，抑制Tc細胞的表達。雷公藤多苷高濃度情況下抑制Tc細胞表達與對照組比較差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。雷公藤多苷中濃度組與對照組、低濃度組與對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。而各濃度組之間比較差異無統計學意義。

雷公藤多苷高濃度可以可以顯著降低ACD小鼠體外培養的CD3+淋巴細胞數量，抑制CD3+細胞的表達，（P＜0.01）。

4討論

ACD發病機理屬于Ⅳ型變態反應。外界致敏物質與皮膚初次接觸后，與表皮的郎格罕細胞結合。當帶有抗原的郎格罕細胞刺激了在淋巴結中的未分化淋巴細胞時，使其開始分裂，并分化成致敏T淋巴細胞克隆并作為效應細胞再經過體內循環到皮膚。當皮膚再次接觸同一物質時，即可被效應T淋巴細胞識別，使該細胞激活，并大量分化和釋放淋巴因子產生各類效應[2]。

T細胞表面的T細胞識別抗原，是鑒別和分離T細胞和T細胞亞群的重要依據。CD3分子表達在人全部T細胞上，CD4分子分布在T細胞的輔助細胞亞群表面，而CD8分子分布在抑制性T淋巴細胞和殺傷性T淋巴細胞表面，在鑒別Tc細胞亞群中有重要作用。

參與Ⅳ型超敏反應的T細胞包括CD4+和CD8+的兩個亞群， T細胞在局部擴增，直接或通過細胞因子間接損傷帶有抗原的靶細胞，導致細胞的變性和破壞[3]。有研究表明，在抗原致敏的局部皮膚，早在臨床癥狀及組織學改變出現以前即出現了CD8+T細胞的迅速聚集，而CD4+T細胞的浸潤則出現較晚并與皮膚炎癥反應的高峰相一致[4]。

本實驗研究顯示多苷對體外培養的ACD小鼠淋巴細胞Th、Tc及CD3+T的表達均有抑制作用。通過減少成熟T淋巴細胞表達，非特異性地降低Ⅳ型變態反應主要效應細胞的表達，阻止了進一步的細胞因子釋放和更多淋巴細胞的活化過程。這種對T淋巴細胞亞群非選擇性、非平衡性的抑制作用，可能使患者機體內存在的各免疫細胞亞群之間的病理性平衡產生改變，使免疫系統的紊亂得以糾正。

參考文獻:

[1]夏志林，鄧福孝.雷公藤多甙制劑的評價[J].中國醫藥工業雜志，1994，25(3):135.

[2]Carter LL，Zhang X，Dubey C，Regulation of T cell subsets from naive to memory[J].J Immunother，1998，21(3):181-187.

[3]Hamad AR，Schneck JP.Antigen-induced T cell death is regulated by CD4 expression[J].Int Rev Immunol，2001，20(5):535-546.

[4] Vocanson M， Hennino A，Cluzel-Tailhardat M，et al.CD8+ T cells are effector cells of contact dermatitis to common skin allergens in mice[J].J Invest Dermatol，2006，126(4):815-820.

編輯/申磊