miR-222在糖尿病腎病中的表達變化及臨床意義

摘要：目的探討miR-222在糖尿病腎病患者血清中的表達及臨床意義。方法采用qRT-PCR方法檢測35例糖尿病腎病患者和35例健康對照者血清中mi-222 的表達水平，并分析miR-222的表達水平與各臨床病理參數的關系。結果miR-222在糖尿病腎病患者血清中的表達水平明顯高于健康對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05)；經相關性分析顯示，miR-222在尿毒癥組糖尿病腎病患者血清中的表達水理較非尿毒癥組明顯增高(P＜0.05)。結論miR-222在糖尿病腎病患者血清中表達上調可能參與糖尿病腎病的發病進程。

關鍵詞：miR-222；糖尿病腎病；實時熒光定量PCRmiRNA是一類長度約為22nt的單鏈，非編碼RNA分子，能與靶基因3′非編碼區特異性結合，在轉錄后水平調控基因的表達，從而導致靶mRNA降解和翻譯阻遏[1]。miRNAs大約調控人類1/3的蛋白編碼基因的表達。miRNAs 調控重要的生物學過程，包括發育、細胞增殖和凋亡、細胞分化、代謝等[2]。miR-222在多種疾病中表達異常，然而在糖尿病腎病（DN）血清中的表達情況尚未見報道，本次研究通過運用qRT-PCR技術檢測miR-222在糖尿病腎病患者血清中的表達，從而分析其與各臨床病理參數之間的意義。

1資料與方法

1.1一般資料選擇35例于2011 年8 月~2013 年7 月在南華大學第一附屬醫院內分泌科確診為糖尿病腎病患者作為研究對象。收集其血清標本共35例，其中男15例，女20例；年齡35~72歲，平均（54.2±4.6）歲；DN按臨床分期分為五期，其中Ⅰ-Ⅳ期(非尿毒癥組)為21例，Ⅴ期(尿毒癥組)為14例。選取35例健康體檢的正常血清作為陰性對照。所有標本于-80℃保存，以上標本收集均通過衡陽市及本院倫理委員會批準并簽署了知情同意書。

1.2主要試劑用于qRT-PCR的miRNA引物由invitrogen公司合成；RNA 抽提試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒和qRT-PCR miRNA Detection Kit購自廣州銳博生物技術公司。

1.3 qRT-PCR實驗方法采用RNA抽提試劑盒提取標本中總RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR擴增反應為20μl體系，包括：Taq DNA polymerase 5U/μl）0.2μl，2×SYBR Mix 10μl，miRNA RT product 2.0μl， MiR-PCR primers（5μM）0.4μl，滅菌蒸餾水7.4μl。循環體系為: 95°C 3inin， 95°C 12s. 62°C 35s， 72°C 30s， 40 個循環。以β-actin為內參，所測定的miRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT法分析。

1.4統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，當P<0.05時，為差異有統計學意義。

2結果

2.1 miR-222在DN患者和健康對照者血清中表達水平的檢測收集35例DN患者和35例健康對照者血清，提取血清中總RNA，運用實時熒光定量PCR檢測血清中miRNA-222的表達水平。結果顯示，35例DN患者血清miR-222的表達水平是健康對照者的8.801倍。選取1例健康對照者血清的miR-222的值為1，然后分析得到35例DN患者血清miR-222的平均表達水平（2-△△CT）為3.582±0.146，健康志愿者血清中miR-222的平均表達水平（2-△△CT）為0.407±0.095，二者相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。結果提示，血清miR-222在DN患者血清中表達明顯上調。

2.2 DN患者血清中miR-222的表達與其臨床病理參數的關系以DN患者血清中miR-222表達值的中位數為臨界值，miR-222表達值大于等于中位數者為高表達，小于中位數者為低表達。結果顯示，miR-222在35例DN患者中有28例高表達（80%），17例低表達（48.6%）。經相關性分析發現，DN患者血清中miR-222的表達與患者年齡（60歲分界）、性別無明顯相關，差異無統計學意義(P>0.05)；然而卻與患者的臨床分期相關，即miR-222在尿毒癥期DN患者血清中的表達水平高與非尿毒癥期DN患者血清中的表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

糖尿病腎病(DN)是我國慢性腎臟疾病的主要病因之一，是導致尿毒癥的第二大病因，在很大程度上促使了糖尿病患者的死亡。因此，DN 嚴重危害了糖尿病患者的健康與生命。DN一般起病隱匿，進展緩慢，缺乏明顯的早期臨床癥狀，而臨床上出現蛋白尿時，其病程進展則難以逆轉，大約50％的DN患者在7年內發展為尿毒癥期。因此，尋找DN早期診斷的生物標志物成為當務之急。miRNA 作為人體天然的基因調控因子，在人類的多種生物學過程如：胚胎發育、細胞分化和代謝、血管的形成以及多種腫瘤的發生發展中發揮重要的調控作用。研究顯示，miRNA不僅在細胞內表達，而且也在血清和其他的體液中表達[3]。近年來，檢測患者外周血液中miRNA的表達用于病癥的早期診斷已成為當前研究的熱點，可能成為多種病癥早期診斷的新方法。

從形態學上，糖尿病腎病主要是以腎小管-間質纖維化，腎小球基底膜增厚，系膜外基質增生為特點，從而導致纖維化，其主要原因是細胞外基質(ECM)的積聚所致。目前研究顯示，多種miRNA參與DN的發生發展，Kato[4]等研究表明miR-192在小鼠腎系膜細胞中表達上調，其通過直接靶向sIPl促進TGF-β 介導的腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質的合成，從而參與糖尿病腎病的發生發展。研究還顯示，miRNA-216a 通過下調其靶基因YB-1，從而調控TGF-β1 的轉錄。Long[5]等證實miRNA-93 能靶向血管內皮生長因子A(VEGFA)，從而使高糖環境中VEGFA 表達下調，而VEGFA在腎小球的形成和功能方面具有重要的調節作用。

本次研究采用qRT-PCR 方法檢測miRNA-222在DN患者和健康對照者血清中的表達，發現miR-222在DN組的表達水平明顯高于健康對照組，且經相關性分析發現，尿毒癥組DN患者血清中miR-222的表達水平明顯高于非尿毒癥組DN患者，表明miR-222在DN的發病進程中可能發揮重要作用，而且有可能成為DN早期診斷的生物標志物。

參考文獻:

[1]Tang H， Deng M， Tang Y， et al. miR-200b and miR-200c as Prognostic Factors and Mediators of Gastric Cancer Cell Progression[J]．Clin Cancer Res，2013，19(20):5602-5612.

[2]Tang H， Kong Y， Guo J， et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]．Cancer Lett，2013，340(1):72-81.

[3]唐云云，唐海林，蘇琦．miRNA在胃癌中的生物學作用[J]．中國腫瘤臨床， 2014， 41(2):131.

[4]Kato M， Zhang J， Wang M， et al. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-β-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors [J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007，104(9):3432-3437.

[5]Long JY， Wang Y， Wang WJ， et al. Identification of microRNA-93 as a novel regulator of vascular endothelial growth factor in hyperglycemic conditions[J]. J Biol Chem， 2010 ，285(30):23457-23465.編輯/申磊