大鼠PDGF—C基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

摘要：目的 構(gòu)建并鑒定大鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子C（PDGF-C）基因的真核表達(dá)載體。方法 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因序列，設(shè)計(jì)合成大鼠PDGF-C基因CDS擴(kuò)增引物，RT-PCR法獲得目的基因，T載體連接測(cè)序后，構(gòu)建pEGFP-N1-PDGF-C真核表達(dá)載體，雙酶切鑒定。結(jié)果 RT-PCR 擴(kuò)增大鼠PDGF-C基因片段為1053bp，與預(yù)期大小相符；測(cè)序結(jié)果表明該目的基因序列與GenBank 公布序列一致；構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PDGF-C雙酶切鑒定正確。結(jié)論 成功構(gòu)建了大鼠PDGF-C基因的真核表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：大鼠；PDGF-C基因；載體構(gòu)建

Abstract：Objective To construct and identify a eukaryotic expression plasmid of rat PDGF-C gene. Methods An rat PDGF-C gene fragment was amplified and sequenced， then cloned into pEGFP-N1 to construct the eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-PDGF-C. The recombinant plasmid was identified by using double restriction enzyme digestion. Results The RT-PCR product was a gene fragment with 1053bp， and the nucleotide sequence of that was consistent with the sequence of the rat PDGF-C gene registered in GenBank. The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-PDGF-C was identified and verified as correct by double restriction enzyme digestion. Conclusion A recombinant eukaryotic plasmid of rat PDGF-C gene was successfully constructed.

Key words： Rat； PDGF-C gene； Vector construction

血小板源生長(zhǎng)因子C（Platelet-derived growth factor C，PDGF-C）是近些年發(fā)現(xiàn)的PDGF家族新成員，在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、纖維化疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[1]。設(shè)計(jì)并構(gòu)建PDGF-C基因的真核表達(dá)載體，為后續(xù)相關(guān)研究提供研究基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 pEGFP-N1真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶BglII和SalI、T4DNA 連接酶、LA Taq 聚合酶 （帶2×GC Buffer I）、dNTPs、及pMD18-T載體購自TaKaRa公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 購自Fermentas公司；Trizol Reagent、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker、DNA回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生物有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；SD大鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PDGF-C基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)已發(fā)表大鼠PDGF-C基因序列（GenBank Accession No. NM_031317），應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成大鼠PDGF-C基因的CDS擴(kuò)增引物。上游引物：5'- GAAGATCTATGCTCCTCCTCGGCCTC-3'，下游引物：5'-ACGCGTCGACCCCTTCTGTG TTTCCTCTA CACAC-3'，在上下游引物的5'端分別引入BglII和SalI的酶切位點(diǎn)，并加入保護(hù)堿基，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。Trizol 試劑提取SD大鼠肝臟組織總mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，在LA Taq 酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 50s，循環(huán)30次；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物膠回收后，連接到pMD18-T載體上（命名為T-PDGF-C），轉(zhuǎn)化后小量提取該質(zhì)粒，酶切鑒定后送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。……