人線粒體融合蛋白—2基因真核表達載體的構建與鑒定

摘要：目的 構建人線粒體融合蛋白-2 （mitofusin-2， MFN2）基因真核表達載體并對其進行鑒定。方法 在pEGFP-N1載體多克隆位點插入人MFN2基因編碼區序列，酶切、測序驗證是否插入及正確性。將所構建載體轉染原代培養的人血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs），熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達；熒光定量PCR和Western blot分別檢測MFN2 的mRNA及蛋白表達。結果 成功構建了人MFN2 基因真核表達載體，其轉染VSMCs后，可以檢測到MFN2 mRNA及蛋白水平高表達（P<0.01）。結論 成功構建了人MFN2基因真核表達載體，且能夠在原代VSMC中過表達。

關鍵詞：線粒體融合蛋白-2；載體構建；鑒定

血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的增殖是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心環節。線粒體融合蛋白-2 （mitofusin-2， MFN2）是一種細胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖[1，2]。本研究擬通過構建人MFN2基因真核表達載體，并將其轉染原代人臍靜脈平滑肌細胞，熒光定量PCR法及Western blot檢測MFN2 mRNA及蛋白表達，為今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細胞由本實驗室培養；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；大腸桿菌感受態DH5α購自北京博邁德生物科技公司；真核基因表達載體pEGFP-N1購自 Clontech公司；Taq DNA 聚合酶購自寶生物公司；限制性內切酶Bgl II及EcoR I、T4 DNA連接酶均購自Fermentas 公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；TRIzol試劑、轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細胞人臍靜脈平滑肌細胞培養與鑒定 采用于海嬌[3]等方法培養及鑒定原代培養的人臍靜脈平滑肌細胞。

1.2.2人MFN2基因真核表達載體的構建 在NCBI網站查找人 MFN2 mRNA編碼區序列，并設計引物。……