人線粒體融合蛋白—2基因真核表達載體的構建與鑒定

摘要：目的 構建人線粒體融合蛋白-2 （mitofusin-2， MFN2）基因真核表達載體并對其進行鑒定。方法 在pEGFP-N1載體多克隆位點插入人MFN2基因編碼區序列，酶切、測序驗證是否插入及正確性。將所構建載體轉染原代培養的人血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs），熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達；熒光定量PCR和Western blot分別檢測MFN2 的mRNA及蛋白表達。結果 成功構建了人MFN2 基因真核表達載體，其轉染VSMCs后，可以檢測到MFN2 mRNA及蛋白水平高表達（P<0.01）。結論 成功構建了人MFN2基因真核表達載體，且能夠在原代VSMC中過表達。

關鍵詞：線粒體融合蛋白-2；載體構建；鑒定

血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的增殖是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心環節。線粒體融合蛋白-2 （mitofusin-2， MFN2）是一種細胞增殖抑制因子，能抑制VSMCs增殖[1，2]。本研究擬通過構建人MFN2基因真核表達載體，并將其轉染原代人臍靜脈平滑肌細胞，熒光定量PCR法及Western blot檢測MFN2 mRNA及蛋白表達，為今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細胞由本實驗室培養；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；大腸桿菌感受態DH5α購自北京博邁德生物科技公司；真核基因表達載體pEGFP-N1購自 Clontech公司；Taq DNA 聚合酶購自寶生物公司；限制性內切酶Bgl II及EcoR I、T4 DNA連接酶均購自Fermentas 公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；TRIzol試劑、轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；兔抗人MFN2抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細胞人臍靜脈平滑肌細胞培養與鑒定 采用于海嬌[3]等方法培養及鑒定原代培養的人臍靜脈平滑肌細胞。

1.2.2人MFN2基因真核表達載體的構建 在NCBI網站查找人 MFN2 mRNA編碼區序列，并設計引物。上游引物：5'-GAAGATCTATGTCCCTGC TCTT CTCTCGAT-3'；下游引物：5'-GGAATTCTCTGCTG GGCTGCAGGTACT-3'，上下游引物分別引入BglII及EcoR I酶切位點（以下劃線標出）。TRIzol法提取人臍靜脈平滑肌細胞總RNA并反轉錄為cDNA，進行PCR擴增；膠回收進行酶切-連接后轉化DH5α大腸桿菌，提取質粒經BglII及EcoR I雙酶切及測序鑒定。測序正確者命名為pEGFP-MFN2。

1.2.3細胞轉染 將細胞接種于24孔細胞培養板中，待細胞融合60%～80%時，設置pEGFP-N1空質粒對照組及pEGFP-MFN2轉染組，每組設三個復孔。按照Lipofectamine 2000說明書步驟進行，轉染各組后37℃細胞培養箱中繼續培養，6h后更換完全培養液。48h后用熒光顯微鏡觀測各組細胞綠色熒光蛋白（GFP）表達情況。

1.2.4熒光定量PCR檢測MFN2 mRNA的表達 提取轉染pEGFP-MFN2細胞的總RNA并反轉錄為cDNA進行熒光定量PCR。以GAPDH為內參照，根據PCR儀自動生成的Ct值，根據公式：目的基因的相對量=2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.2.5 western blot檢測MFN2 蛋白的表達 按照全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白進行SDS-PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h， 分別用抗MFN2和抗β-actin抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜；辣根過氧化物酶（1：3000）室溫標記1 h，TBST洗膜；X光膠片曝光、顯影、定影。照像并分析，以β-actin 蛋白為內參，用MFN2與β-actin條帶像素灰度的比值表示MFN2 蛋白的相對表達量。

1.3統計學分析 結果以 表示，應用SPSS 11.0統計學軟件進行統計學分析，采用t檢驗進行兩樣本間比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

3討論

MFN2 是近年發現的具有許多生物學功能的蛋白，在VSMCs以及心、腎等組織中廣泛分布[4]。研究發現，高血壓大鼠、球囊損傷大鼠和ApoE基因敲除小鼠的VSMCs中Mfn2表達均明顯下調。我國學者陳光慧等[1]首次發現MFN2基因控制VSMCs增殖，其機制主要在于MFN2是原癌基因Ras的直接負調控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-Raf-MAPK信號轉導通路而將細胞周期阻斷在G0/G1期。研究還發現，血管緊張素II、內皮素-1及IL-1等可以通過下調MFN2表達，促進VSMCs的增殖，而相應的受體阻斷劑可以阻斷該作用；MFN2的表達水平可受到心鈉素和腎上腺髓質素的正調節，從而抑制VSMCs的增殖[4]。為了進一步明確MFN2的作用，我們初步構建了含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）報告基因的人MFN2真核重組表達載體。結果表明成功構建了人MFN2 基因真核表達載體，并且將其其轉染原代培養的VSMCs，利用熒光定量PCR及Western blot可以檢測到MFN2 mRNA及蛋白水平高表達，說明載體構建成功而且成功表達于原代VSMCs，將為今后深入研究MFN2的功能及在AS中的作用奠定了基礎。

參考文獻：

[1]CHEN K H，GUO X，MA D，et al.Deregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders[J].Nat Cell Biol，2004，6（9）：872-883.

[2]Gerhard M， RoddyM A， Greager SJ， et al. Ageing progressively impairs endothelium-dependent vasodilation in forearm resistance vessels of human[J].Human， 1996， 27（4）：849-853.

[3]于海嬌，馬琳娜，徐支芳，等.同型半胱氨酸對血管平滑肌細胞周期及P27和CyclinA表達的影響[J].中國現代醫學雜志，2011，21（36）：4487-4492.

[4]Chien KR，Hoshijima M. Unraveling ras signals in cardiovascular disease[J].Nature Cell Biology 2004，6：807-808.

編輯/孫杰