p21基因啟動子甲基化對血管平滑肌細胞向泡沫細胞轉化的影響

摘要：目的 觀察氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）對血管平滑肌細胞（VSMC）p21基因啟動子甲基化及對VSMC向泡沫細胞轉化的影響。方法 采用組織貼塊法培養人臍血管平滑肌細胞，給予不同濃度氧化低密度脂蛋白ox-LDL（0，10mg/L，20mg/L，40mg/L）孵育24h，甲基化特異PCR（MS-PCR）檢測p21基因啟動子區CpG島甲基化程度，MTT比色法測定VSMC增殖活性，油紅O染色鏡下觀察計數泡沫細胞比率。結果 ox-LDL呈濃度依賴性促進p21啟動子甲基化，同時平滑細胞增殖活性增高，向泡沫細胞轉化增加。結論 ox-LDL 可以通過p21基因甲基化促進VSMC向泡沫細胞轉化，p21基因甲基化可能在動脈粥樣硬化發生中起到一定作用。

關鍵詞：p21基因；甲基化；動脈粥樣硬化

動脈中膜血管平滑肌細胞（VSMC）發生增殖和遷移并轉化為泡沫細胞是動脈粥樣硬化（AS）形成過程中的核心事件。細胞周期是各種因素刺激細胞增殖的最后信號通路，p21是體內最重要的細胞周期蛋白，可與幾乎每一個Cyclin-CDK復合物結合并使其失活，從而阻礙細胞進入增殖期。p21等在高膽固醇等促AS因子作用下表達下調，導致動脈平滑肌細胞增殖和遷移， 但在此過程中沒有發現p21基因的突變，從而使傳統遺傳學理論對此無法解釋。表觀遺傳學理論，尤其是DNA甲基化為解決AS等多基因遺傳疾病提供了新的思路。DNA甲基化不改變基因編碼序列，但啟動子區高甲基化將導致基因表達抑制和基因沉默。本課題觀察p21基因甲基化對泡沫細胞形成的影響，為闡明AS發病機制提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料 Gp Genome DNA修飾試劑盒購自Chmicon，PCR試劑盒購自賽百盛公司，四甲基偶氮唑鹽和二甲基壓砜購自Sigma公司，細胞培養基、小牛血清等購自Gibico。常規化學試劑為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1人血管平滑肌細胞的培養：無菌取剖宮產胎兒臍動脈，剝取中膜按貼塊法培養VSMC，取第3-5代用于實驗研究。實驗前以無血清培養基培養12h使細胞處于靜止狀態。在無血清培養液中加入0.2%牛血清白蛋白，然后加入不同濃度OX-LDL刺激24h，未加刺激同時孵育24h細胞作為對照。

1.2.2氧化低密度脂蛋白的制備（ox-LDL）：采用非連續性密度梯度超速離心法分離提取LDL。新鮮人不抗凝血低速離心分離血清，用溴化鉀調節密度至1.3g/ml，4°C 50000r/min離心5h，收集LDL，PBS透析，超濾除菌后4°C保存。Lowry法定氮，采用硫酸銅誘導氧化修飾，置于PBS中透析24h后4°C保存備用。

1.2.3 p21 基因甲基化檢測：采用甲基化特異性PCR法。飽和酚-氯仿法提取樣本DNA，取溶解的DNA樣本1ug，參照Gp Genome DNA修飾試劑盒（Chmicon公司）應用亞硫酸鹽修飾，回收后提純行PCR反應。p21甲基化特異引物上游序列為5′-TACGCGAGGTTTCGGGATCG-3′，下游序列 5′-AAAAACGACCCGCGCTCG-3′，擴增產物片段為133bp；p21非甲基化特異引物上游序列為5′-TATGTGAGGTTTTGGGATTGG-3′，下游序列 5′-AAAAACAACCCACACTCAACC-3′，擴增產物片段為133bp。引物由賽百盛生物公司合成。建立50μl反應體系，內含10×反應緩沖5μl ，dNTP1μl，上下游引物各20pmol，Taq酶0.5單位，模板 DNA 5μL，雙蒸水補至50μl，覆蓋石蠟油，940C 5min 后，進入940C變性1 min ，670C復性1 min ，720C延伸1 min的循環，共35個循環，最后720C延伸5 min，產物行瓊脂糖凝膠電泳分離，拍照后掃描條帶，以同一樣本甲基化條帶與非甲基化條帶之比進行甲基化程度半定量。

1.2.4 細胞增殖活力檢測 MTT比色法。細胞棄去培養液，PBS洗滌，再加入20μL MTT工作液及200μL培養液，4h后吸去上清，每孔加入二甲基亞砜150μL，充分振蕩使結晶物融解，490mm波長在酶標儀上測定各孔光吸收值，以試驗孔OD均值/對照孔OD均值作為細胞增殖的相對活性。

1.2.5 泡沫細胞的半定量 細胞油紅\"O\"染色，拍照后利用圖像掃描儀根據細胞脂滴的面積進行細胞分類。細胞脂滴的面積小于細胞核的面積者記為\"-\"，面積等于或大于細胞核的面積記為\"+\"，即為泡沫細胞，每一塊玻片計數100個細胞，計算泡沫細胞的陽性率

1.3統計學分析 計量資料數據采用x±s表示，計數資料以百分比（%）表示，所有統計分析均在SPSS12.0軟件上進行。P<0.05認為差異有統計學意義。

3討論

動脈粥樣硬化是嚴重危害人類健康的血管疾病，其發病機制復雜，迄今尚未闡明。血管平滑肌細胞的增殖和遷移受周期依賴激酶（CDK）和細胞周期蛋白共同作用而完成，尤其是G1期過渡到S期受周期蛋白依賴激酶抑制因子的調節。p21是體內最重要的細胞周期蛋白，可與幾乎每一個Cyclin-CDK復合物結合并使其失活，從而阻礙細胞進入S期。在高膽固醇等促AS因子作用下， p21等抑制增殖因子表達降低，導致SMCs增殖和遷移，成為富含脂質的泡沫細胞 [4]。

基因的甲基化是表觀遺傳學上對基因表達進行調控的一種常見機制，是最常見的復制及轉錄后修飾方式，常常導致基因的表達抑制。DNA甲基化是指在甲基轉移酶介導下CpG 二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子加上一甲基基團，變成5-甲基胞嘧啶[3]。高度保守的管家基因啟動子區富含CpG 二核苷酸，啟動子區高甲基化導致基因表達抑制，使該基因沉默和失活[1]。

研究發現相關基因的甲基化在動脈粥樣硬化發生發展中起著重要作用。對同型半胱氨酸（Hcy）的研究提示Hcy濃度升高會影響體內許多物質的甲基化過程，Hcy已被認為是獨立的致AS危險因子[3，8]。已知AS患者粥樣斑塊中雌激素受體α（ER2α） 基因的甲基化水平顯著增高；體外試驗結果證實Hcy可以促進VSMCs向泡沫細胞轉化，同時伴有ER2α甲基化增加，上述結果提示ER2α基因表達沉默與AS 形成間存在相關性[8，10]。對動脈粥樣硬化兔頸動脈斑塊p53基因檢測提示其甲基化程度明顯增高。

VSMCs的增殖和遷移是動脈粥樣硬化的主要病理特征之一，本研究結果表明ox-LDL可以通過影響DNA的甲基化修飾引起p21高甲基化，這可能是其促VSMCs增殖進而引起動脈粥樣硬化的重要機制。

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編輯/王海靜