廣譜抗生素對(duì)大鼠腸道菌群多樣性影響的16SrDNA基因測(cè)序研究

姚增武，仲蓓，王東升，曹守根，王松，周巖冰

（1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，山東 青島 266003； 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院高壓氧科； 3 淄博市淄川區(qū)人民醫(yī)院）

人類(lèi)胃腸道存在大約1014個(gè)細(xì)菌，種類(lèi)超過(guò)了1 000種。腸道細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)吸收及代謝、維生素的產(chǎn)生、病原體的抵抗以及免疫系統(tǒng)的形成和維持等生理功能上發(fā)揮重要的作用。因腸道細(xì)菌的多樣性和功能的豐富性，有人甚至將腸道細(xì)菌比作人體的一個(gè)“器官”［1－3］。研究表明，抗生素對(duì)于人類(lèi)腸道菌群的平衡有重要的影響［4］。但上述研究通常采用的是細(xì)菌培養(yǎng)基的方法，這種方法只能確定20%～40%的腸道細(xì)菌的種類(lèi)，有很大的局限性。近年來(lái)，16SrDNA基因高通量測(cè)序方法的發(fā)展使得我們可以檢測(cè)到絕大多數(shù)的腸道細(xì)菌［5］。本研究通過(guò)采用16SrDNA基因測(cè)序這種更準(zhǔn)確的技術(shù)，旨在明確廣譜抗生素對(duì)大鼠腸道菌群多樣性的影響。?

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供）24只，8周齡，體質(zhì)量（250±10）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，于（23±2）℃和相對(duì)濕度為（50±5）%的無(wú)特殊病原體環(huán)境下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 試劑及藥物 注射用頭孢唑林鈉（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司）；糞便基因組DNA快速提取試劑盒及DNA Marker（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；Premix Taq Version 2.0（Takara生物技術(shù)有限公司）。電泳緩沖液的配制：將Tris 242g、Na2EDTA·2H2O 37.2g，置于1L燒杯中，向燒杯中加入約800mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓尤?7.1mL的乙酸，充分?jǐn)嚢瑁尤ルx子水將溶液定容至1L后，室溫下保存。瓊脂糖溶液的配制：稀釋100mL的5×TBE溶液至500mL，取100mL溶解3g瓊脂糖，煮沸，混勻直至沒(méi)有氣泡，冷卻至60℃時(shí)加入10g／L EB 5μL，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的電泳板中，室溫放置45min。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將 Wistar大鼠24只隨機(jī)分為一次應(yīng)用抗生素組（A組）、多次應(yīng)用抗生素組（B組）和對(duì)照組（C組），每組均為8只。A組：第一天按100mg／kg劑量腹腔注射頭孢唑林鈉，第2、3天分別用等量的生理鹽水腹腔注射一次；B組：按100mg／kg劑量腹腔注射頭孢唑林鈉，并且連續(xù)用藥3d；C組：腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)3d。

1.2.2 糞便標(biāo)本的收集及保存 收集3組大鼠用藥前1d和用藥結(jié)束后第1次糞便（大于2g）于無(wú)菌容器中，－80℃保存。

1.2.3 糞便標(biāo)本DNA的提取 糞便標(biāo)本解凍以后，按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒的操作手冊(cè)逐步操作，提取細(xì)菌DNA。

1.2.4 細(xì)菌DNA的擴(kuò)增 進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA V3可變區(qū) PCR 擴(kuò)增，引物選擇338F／533R（5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′／5′ TTACCGCGGCTGCTGGCAC3′，深圳華大基因科技公司合成），試劑選擇Premix Taq。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，58℃45s，72℃1 min，共20個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。采用Qubit Fluorometer及瓊脂糖凝膠電泳定量檢測(cè)樣本質(zhì)量，選擇DNA濃度均大于50mg／L、總量大于3ng的24份樣品進(jìn)行16SrDNA基因高通量測(cè)序。

1.2.5 細(xì)菌16SrDNA測(cè)序分析 用16SrDNA的高可變區(qū)Illumina測(cè)序技術(shù)，對(duì)樣品的16SrDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到原始的數(shù)據(jù)和reads。將reads進(jìn)行去除接頭序列、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列的處理。將含有上述序列的reads去掉后，得到每個(gè)樣品的Clean Data。對(duì)于這些reads進(jìn)行Overlap拼接，形成目標(biāo)序列Tag。對(duì)Tag序列進(jìn)行去冗余處理，挑選出Unique Tag序列。將Unique Tag序列按照豐度從高到低排序，然后按照0.02的差異（或98%的相似度）進(jìn)行預(yù)聚類(lèi)。預(yù)聚類(lèi)后的Tags在0.03距離下（或97%的相似度）計(jì)算OTU數(shù)量，并采用眾數(shù)原則對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種注釋?zhuān)词紫冉y(tǒng)計(jì)該OTU中所有Tags的物種注釋信息，如果66%的Tags都支持同一個(gè)物種分類(lèi)單元，那么該物種分類(lèi)就作為該OTU的物種分類(lèi)信息。

1.2.6 腸道細(xì)菌多樣性指數(shù) 根據(jù)每個(gè)樣品中的OTU總數(shù)和每個(gè)OTU的相對(duì)豐度進(jìn)行樣品多樣性指數(shù)的計(jì)算。Chao1和ACE指數(shù)是根據(jù)所測(cè)得OTU的數(shù)量來(lái)預(yù)測(cè)樣品中微生物種類(lèi)，其值越大，物種越豐富；Shannon和Simpson指數(shù)是基于樣品的所有OTU豐度和均勻度及其注釋物種信息，反映腸道菌群中所有物種的種類(lèi)數(shù)及每個(gè)物種個(gè)體數(shù)占群落中總個(gè)體數(shù)比例，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越接近于0，表示樣品中物種越豐富。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

16SrDNA的基因測(cè)序分析采用Mothur V.1.11.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以表示，數(shù)據(jù)間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)和成組t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對(duì)24份糞便樣本DNA的16SrDNA V3區(qū)進(jìn)行Illumina測(cè)序，得到約8.24Gb的原始數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本產(chǎn)出約33 000條reads，經(jīng)過(guò)去除接頭序列、低復(fù)雜度序列和低質(zhì)量序列后，每個(gè)樣本大約得到了80%的Clean Data。將這些reads進(jìn)行Overlap拼接，得到的Tag序列，其長(zhǎng)度分布在134、152和157bp左右，這與多數(shù)細(xì)菌V3區(qū)域的長(zhǎng)度是一致的。所有樣本預(yù)聚類(lèi)后的Tags在0.03距離下得出OTU數(shù)量為1 859±208。24份樣品均有多于80%的Tag序列能夠注釋到“目”的水平，而能夠注釋到“科”的水平的Tag序列低于60%，選擇“目”作為24份樣品的最佳分類(lèi)水平。

2.1 各組腸道菌群Chao1、ACE指數(shù)變化

A、B組腸道菌群OTU的Chao1、ACE指數(shù)用藥后較用藥前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.3～12.7，P＜0.05）；C 組用藥后腸道菌群 OTU 的Chao1、ACE指數(shù)變化無(wú)顯著性（P＞0.05）。B組Chao1、ACE指數(shù)降低較 A 組更明顯（t＝5.6、5.3，P＜0.05）。見(jiàn)表1、2。

2.2 各組腸道菌群Shannon、Simpson指數(shù)變化

A、B組大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)用藥后較用藥前顯著降低（t＝7.6、12.4，P＜0.05），C組用藥后腸道菌群Shannon指數(shù)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B組的Shannon指數(shù)降低較A組更明顯（t＝－4.1，P＜0.05）。見(jiàn)表3。A、B組腸道菌群Simpson指數(shù)用藥后較用藥前均顯著升高（t＝4.4、9.5，P＜0.05），C組用藥后腸道菌群Simpson指數(shù)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B組的Simpson指數(shù)升高較A組更明顯（t＝5.7，P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表1 各組OTU的Chao1指數(shù)用藥前后的變化（）

表1 各組OTU的Chao1指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝5.3、12.7，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A(chǔ)組 5 303.9±292.7 5 103.0±276.9＊ 200.9± 93.5 B組 5 169.8±265.4 4 670.1±239.5＊ 499.6±119.8 C組5 264.1±363.1 5 240.0±368.3 24.1± 95.1

表2 各組OTU的ACE指數(shù)用藥前后的變化（）

表2 各組OTU的ACE指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝6.2、11.2，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A(chǔ)組 10 108.9±541.3 9 725.8±468.0＊ 383.1±175.3 B組 10 295.9±458.6 9 360.5±467.9＊ 935.4±236.8 C組10 597.9±761.0 10 539.4±755.3 58.5±156.7

表3 各組OTU的Shannon指數(shù)用藥前后的變化（）

表3 各組OTU的Shannon指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝7.6、12.4，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A(chǔ)組 4.323±0.274 2.805±0.585＊ 1.519±0.563 B組 4.101±0.302 1.370±0.685＊ 2.731±0.623 C組4.245±0.280 4.203±0.318 0.041±0.172

表4 各組OTU的Simpson指數(shù)用藥前后的變化（）

表4 各組OTU的Simpson指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝4.4、9.5，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A(chǔ)組 0.087±0.012 0.130±0.033＊ －0.043±0.027 B組 0.092±0.012 0.237±0.049＊ －0.146±0.044 C組0.088±0.011 0.091±0.013 －0.003±0.085

3 討 論

本研究采用16SrDNA的基因測(cè)序方法來(lái)觀察廣譜抗生素用藥時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)大鼠腸道菌群多樣性的破壞程度，高通量測(cè)序技術(shù)通過(guò)對(duì)腸道細(xì)菌的16S rDNA中高可變區(qū)序列的測(cè)序來(lái)確定腸道細(xì)菌種類(lèi)和數(shù)目相對(duì)值，具有高準(zhǔn)確度、高通量、高靈敏度、低成本等優(yōu)勢(shì)。采用的廣譜抗生素為臨床上常用的頭孢唑啉，其抗菌譜廣，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌有良好的抗菌活性；同時(shí)模擬了胃腸外科手術(shù)中抗生素常用的劑量及用藥時(shí)間。結(jié)果顯示，即使一次應(yīng)用抗生素也會(huì)造成大鼠腸道菌群多樣性的破壞，其特征性指數(shù)Chao1、ACE、Shannon降低，Simpson升高，而且抗生素的應(yīng)用時(shí)間越長(zhǎng)，腸道菌群多樣性的降低越顯著，而這些變化在對(duì)照組中卻不明顯。

NOVELLI等［6］研究結(jié)果顯示，支氣管炎病人分別應(yīng)用頭孢克肟（8例）和頭孢呋辛（8例）治療10d，兩組病人腸道細(xì)菌的多樣性顯著下降，腸細(xì)菌和梭菌屬減少較為明顯，同時(shí)伴有腸球菌的增加；頭孢克肟組有4例病人的糞便培養(yǎng)出沙門(mén)菌，而頭孢呋辛組有2例病人的糞便培養(yǎng)出難辨梭狀芽胞桿菌。BRISMAR等［7］研究結(jié)果顯示，14例健康志愿者口服頭孢布坦10d，用藥前后其腸道菌群的多樣性發(fā)生了顯著下降，大腸桿菌和厭氧球菌數(shù)量明顯下降，而腸球菌數(shù)量明顯增加，其中6例志愿者在用藥后的糞便中發(fā)現(xiàn)了難辨梭狀芽胞桿菌。上述結(jié)果與本研究采用高通量測(cè)序方法所得的結(jié)果基本一致。抗生素的應(yīng)用可造成腸道菌群紊亂，其紊亂的程度與抗生素種類(lèi)的選擇、用藥時(shí)間的長(zhǎng)短以及個(gè)體的敏感性等因素有關(guān)。抗生素過(guò)度應(yīng)用極易造成腸道菌群多樣性的破壞，導(dǎo)致很多罕見(jiàn)菌或機(jī)會(huì)性感染細(xì)菌的增殖，從而導(dǎo)致抗生素相關(guān)性腸炎，最為典型的是難辨梭狀芽胞桿菌相關(guān)性腸炎，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［8－10］。

國(guó)際上各個(gè)國(guó)家都存在不同程度的抗生素應(yīng)用不合理的問(wèn)題，這在我國(guó)表現(xiàn)得尤為突出。黎沾良等［11］對(duì)我國(guó)118所三級(jí)綜合性醫(yī)院的圍手術(shù)期抗菌藥物使用狀況的調(diào)查結(jié)果顯示，不合理、不規(guī)范的現(xiàn)象十分突出，如抗菌藥物的使用率過(guò)高、抗菌藥物選擇不合理、聯(lián)合用藥及用藥時(shí)機(jī)不規(guī)范、用藥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、用法用量不規(guī)范等。雖然小劑量短時(shí)間的抗生素應(yīng)用可能未引起相關(guān)的癥狀（如腹瀉、發(fā)熱等），但是其腸道菌群多樣性可能已經(jīng)發(fā)生了變化，并且導(dǎo)致一些潛在致病菌的增殖，這都可能形成抗生素相關(guān)腸炎的潛在風(fēng)險(xiǎn)。臨床工作中，抗生素相關(guān)性腸炎的發(fā)生在胃腸道外科最為常見(jiàn)，這與圍手術(shù)期抗生素的應(yīng)用、手術(shù)對(duì)于胃腸道黏膜屏障等的直接損傷、術(shù)前灌腸及禁食等相關(guān)，而圍手術(shù)期抗生素的應(yīng)用則起到了主要的作用［12］。抗生素的使用是一把雙刃劍，最佳的效果是既能保證其抗感染的功效又能將其對(duì)腸道微生態(tài)平衡的破壞降至最低。因此在臨床工作中，應(yīng)嚴(yán)格把握抗生素適應(yīng)證及用法、用量，合理使用抗生素，避免過(guò)度使用。人體腸道細(xì)菌有一定的彈性，在抗生素使用后可不同程度地恢復(fù)［13］。本研究尚未觀察大鼠腸道菌群的恢復(fù)情況，將來(lái)有待于對(duì)大鼠腸道細(xì)菌的彈性及恢復(fù)性做進(jìn)一步的研究。

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