動態濁度法測定阿奇霉素中細菌內毒素含量

張 娟,祝清芬,范治云,魏 霞,史國生

（山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南 250101）

阿奇霉素為大環內酯類抗生素,與紅霉素的化學結構和作用機制有共同點,屬抑菌性抗生素,對酸穩定,半衰期長[1],有較高的生物利用度。它可通過與細菌核糖核蛋白體的50 s亞單位結合妨礙肽鏈的延長,影響細菌蛋白合成而達到抑菌作用。其應用方便、療程短、療效肯定,具備理想抗生素的條件,對青霉素過敏及兒科患者更有實際意義[2]。其臨床用于治療各種敏感性細菌引起的上呼吸道感染、泌尿道感染和皮膚軟組織感染[3-5]。細菌內毒素檢查法是控制藥物注射劑重要的安全性指標[6]。阿奇霉素的質量標準（內部標準）中規定了細菌內毒素檢查項,限值規定應小于0.2 EU/mg。在實際工作中發現,某些樣品由于pH等原因,對凝膠法細菌內毒素檢查有明顯的干擾作用。本試驗中參照2010年版《中國藥典（二部）》[7]細菌內毒素檢查方法中的動態濁度法,對阿奇霉素中的細菌內毒素定量檢測進行了研究,以尋求一種快速、準確的定量檢測方法。

1 儀器與試藥

BET-48G型細菌內毒素測定儀（天大天發科技有限公司）；ZH-2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；試驗用試管、刻度吸管等玻璃器材按規定清洗,250℃干烤1 h除去外源性內毒素。阿奇霉素原料（煙臺只楚藥業有限公司,批號分別為1205004,1205005,1205006）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院,批號為150601-201174,規格為每支160 EU）；細菌內毒素檢查用水（BET用水,湛江安度斯生物有限公司,批號為1209030,規格為每支5 mL）；動態濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司,批號為1301212,可測內毒素范圍0.01～10EU/mL,規格為 1.25 mL,有效期至2015年12月）。

2 方法與結果[7-9]

2.1 細菌內毒素標準曲線的建立和可靠性分析

設定標準曲線各點濃度為 2.0,0.5,0.125,0.03125 EU/mL。用BET用水稀釋細菌內毒素標準品,使其最終濃度分別為2.0,0.5,0.125,0.03125 EU/mL,各取 0.1 mL,分別加至預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內,混合均勻,插入BET-48G型細菌內毒素檢測儀進行檢測,每個濃度重復3管,同時做陰性對照（NC）。以平均反應時間的對數（lg T）為縱坐標、內毒素濃度的對數（lg C）為橫坐標繪制標準曲線,得回歸方程lg T=-0.2369 lg C＋2.8123,r=-0.9989（絕對值應大于 0.980）,平行管之間的 RSD 均小于10%,陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間,細菌內毒素標準曲線成立。結果見表1。

表1 細菌內毒素標準曲線及可靠性分析結果（n=3）

2.2 供試品制備及最小有效稀釋質量濃度的確定

阿奇霉素在水中幾乎不溶,在甲醇、丙酮、三氯甲烷、無水乙醇或稀鹽酸中易溶。先采用0.05 mol/L稀鹽酸溶解供試品,制得25 g/L的供試品溶液,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節 PH至中性。本品細菌內毒素限值（L）為 0.2 EU/mg,標準曲線最低濃度（λ1）為 0.03125 EU/mL,供試品的 MVD = CL/λ1=160 倍,及最小有效稀釋質量濃度為0.15625 g/L。

2.3 干擾試驗

根據標準曲線內毒素濃度的設置,選擇0.25EU/mL作為 λm。選擇批號為1205004的阿奇霉素,用0.05 mol/L稀鹽酸溶解供試品,制得25 g/L的供試品溶液,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至中性。用BET用水進行稀釋,使其終質量濃度分別為2.5,1.25,0.625,0.3125,0.15625 g/L,作為供試品溶液（A 液）,同時制備含上述供試品質量濃度并含內毒素濃度為 λm（0.25EU/mL）的溶液（B液）。分別取上述各液0.1 mL,加至預先加有 0.1 mL鱟試劑的反應管內,混合均勻,插入儀器內測定,每個濃度重復2管。測定結束后,按標準曲線回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素 λm的供試品溶液的內毒素含量,并計算該試驗條件下的回收率（R）。結果見表 2。

表2 供試品干擾試驗及供試品細菌內毒素測定結果（n=2）

由表 2可見,2.5 g/L及以下質量濃度時,回收率均在50%～200%,符合要求,因此建議采用2.5 g/L及以下質量濃度進行試驗。另取批號為1205005和1205006的兩批樣品,分別制備2.5 g/L供試品稀釋液（A液）和濃度相同的供試品且含內毒素濃度 λm（0.25 EU/mL）的溶液（B 液）,依法檢查。結果見表 2,B液回收率均在50%～200%,符合要求。

3 討論

在2010年版《中國藥典（二部）》中,阿奇霉素口服制劑有明確的標準規定,而對注射劑目前還沒有相應標準。化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則中規定,靜脈用注射劑均應設細菌內毒素（或熱原）檢查項。為此,本研究中運用動態濁度法對阿奇霉素進行干擾試驗和細菌內毒素含量的測定。阿奇霉素在水中幾乎不溶解,根據其對酸穩定的性質,本研究中采用0.05mol/L稀鹽酸將其溶解,并將pH調至中性后,進行干擾試驗和細菌內毒素檢查,解決了其溶解性的問題。

由阿奇霉素的干擾試驗結果顯示,阿奇霉素可用細菌內毒素動態濁度法進行檢測,樣品質量濃度為2.5 g/L時,細菌內毒素回收率在50%～200%內,即對試驗無干擾,且3批樣品的內毒素含量均在規定限值0.2 EU/mg以下。

動態濁度法能直觀地反映樣品中細菌內毒素含量,檢測過程及結果處理完全通過儀器執行,具有快速、大范圍定量的特性,使干擾試驗在1～2次試驗后完成,節約成本,克服了凝膠法檢驗結果只能判斷產品的內毒素含量是否超標,而無法給出準確的含量的不足,避免了熱原法由于家兔差異及人為主觀判斷所出現的假陽性或假陰性結果[10-11]。運用動態濁度法測定阿奇霉素中細菌內毒素較以往用凝膠法具有更低的檢測下限,可較準確地反應樣品中內毒素的含量,值得推廣。

參考文獻:

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[8]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:310-321.

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