高效液相色譜法測定5-氟尿嘧啶復乳原位凝膠的含量

王璐璐,陳少華,相 莉,張秀立,鄭穩生

（中國醫學科學院藥物研究所·藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點試驗室,北京 100050）

5-氟尿嘧啶（5-FU）是治療大腸癌的基本用藥,通過抑制胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶,阻礙DNA合成,達到抗腫瘤的作用,現有給藥方式為注射及口服。口服給藥產生的骨髓抑制作用較靜脈注射持久,靜脈注射和靜脈滴注的給藥途徑較好,但注射部位易發生靜脈炎,少數患者發生神經系統和心臟毒性以及維生素B1缺乏癥,長期動脈插管給藥又會引起動脈血栓[1]。動物實驗表明,5-FU栓劑比口服給藥治療直腸癌更有效[2-4],但傳統的栓劑藥物吸收差,對黏膜的刺激性大,藥物停留時間短,患者順應性低,故對氟尿嘧啶的劑型進行了大量探索[5]。本研究中應用原位凝膠技術結合復乳化技術制備了5-FU復乳原位凝膠,旨在提高藥物經黏膜吸收的效率且減少藥物對黏膜的刺激性。筆者采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定該制劑的含量,結果靈敏、準確、可靠。現報道如下。

1 儀器與試藥

HP8453型紫外分光光度計（美國惠普公司）；Agilent1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；HPLCWaters 2487檢測器Waters 515泵；FA1004N型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）。5-氟尿嘧啶（上海諾泰化工有限公司,含量99.3%）；Poloxamer系列為BASF公司贈送；海藻酸鈉（河北大唐生物工程有限公司）；1.2-丙二醇,Tween 80,Span 80（西隴化工股份有限公司）；5-FU復乳原位凝膠（中國醫學科學院藥物研究所,規格為 200 g/L,批號分別為 20130515,20130516,20130517）；5-FU對照品 （中國藥品生物制品檢定所,批號為200602,含量為99.2% ）；Poloxamer 407（BASF 公司贈送）；甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.15-FU復乳原位凝膠的制備[6-10]

5-FU 復乳:將大豆油、Span 80、Tween 80和 1.2-丙二醇按22∶5∶1∶6的比例混合,在 45℃、轉速為 2000 r/min的條件下持續攪拌,逐滴加入1.5%的5-FU水溶液33mL,繼續攪拌10min,得到白色微乳。取15 mL 6%Poloxamer水溶液,在 4℃,轉速為700 r/min的條件下持續攪拌,逐滴加入第一步制得的5-FU微乳15mL,繼續攪拌10min,得白色復乳。

5-FU復乳原位凝膠:取含有適量Poloxamer 407和海藻酸鈉的水溶液,在4℃和轉速為700 r/min的條件下持續攪拌,與一定量5-FU復乳混合,繼續攪拌10 min,緩慢升溫至室溫,得到白色凝膠。

2.2 色譜條件及系統適用性試驗

參考文獻[11],用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,Hypersic-C18柱(150 mm ×4.6mm,5 μm)；流動相:水（用 0.05 mol/L磷酸溶液調節 PH 至 3.5）-甲醇（95∶5）；檢測波長:266 nm；流速:1mL/min。取對照品溶液、樣品溶液及空白溶液,紫外檢測器在200～400 nm波長范圍內進行掃描,5-FU在266 nm波長下有最大吸收,故選擇266 nm作為測定波長。取供試品及對照品溶液20μL,按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀,理論板數按5-FU峰計算應不低于5000,在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 溶液制備

取5-FU復乳原位凝膠1mL,加流動相稀釋至含5-FU10μg/mL的溶液,搖勻,濾過,取續濾液,即得供試品溶液。取5-FU對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并稀釋制成每1 mL含10μg的溶液,即得對照品溶液。取按處方比例制備不含5-FU的空白復乳凝膠,4℃條件下以水為溶劑,配制成含5-FU 10μg/mL的溶液,按供試品溶液制備方法制備,即得空白溶液。

2.4 方法學考察

線性關系考察:精密稱取5-FU對照品適量,用流動相溶解并稀釋成每 1mL含 5-FU 1 mg的溶液。精密量取 6,10,60,100,140,180μL,分別置 10 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,精密量取20μL,分別注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,以峰面積（A）為縱坐標、質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸,得回歸方程 A=61.79C-15.18（r=0.9991）。結果表明,5-FU 質量濃度在0.6～18μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:取同一供試品溶液,連續進樣6次,測定其峰面積。結果 5-FU 的平均峰面積為 648.7,RSD 為 0.11% （n=6）,表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗:精密稱取5-FU對照品適量,加水稀釋成每1mL含5-FU 1mg的貯備溶液。稱取已知含量的5-FU復乳原位凝膠5mL,分別置3個10mL容量瓶中,然后分別加入貯備溶液30,50,70μL,用流動相稀釋至刻度,搖勻,即得相對標示量濃度為80%,100%,120%的溶液,按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表1。

表1 5-FU加樣回收試驗結果（n=6）

穩定性試驗:精密量取同一供試品溶液,分別于 0,2,4,6,12,24 h時測定。結果的 RSD 為 0.72% （n=6）,表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品依法配制供試品溶液,重復進樣5次,依法測定。結果的 RSD為1.27%（n=5）,表明該方法重復性良好。

2.5 樣品含量測定

精密量取供試品溶液20μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。依法制備對照品溶液同法測定,按外標法分別計算峰面積。結果批號為 20130915,20130916,20130917的樣品中 5-FU含量分別為標示量的 97.34% ,103.57% ,96.86% 。

3 討論

根據2010年版《中國藥典（二部）》5-FU含量測定項中的規定,5-FU測定質量濃度為10μg/mL,故標準曲線制訂中5-FU對照品的質量濃度配制在0.6～l8μg/mL范圍。其含量測定采用的是紫外法[12],采用高效液相色譜法測定本品主藥含量,重復性好、專屬性強、靈敏度高、結果準確。

復乳是將水包油（O/W）或油包水（W/O）的初乳進行二次乳化,進一步分散在油相或水相中,形成的多相分散體系。它是抗癌藥物和抗病毒藥物的良好載體,具有流動性好,可以改善藥物的吸收、延緩或控制藥物的釋放。本研究中先將脂溶性差的藥物5-FU制成復乳,并進一步將其制成攜帶有復乳的原位凝膠,可以提高藥物的生物利用度,提高患者的用藥依從性。

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