達比加群酯中空微球的制備及溶劑選擇

劉元芬,丁亞飛,鄭春麗

（1.江蘇建康職業學院,江蘇 南京 210029； 2.中國藥科大學藥物制劑研究所,江蘇 南京 210009）

達比加群酯為新合成的直接凝血酶抑制劑,為dabigatran的前體藥物,屬非肽類的凝血酶抑制劑[1]。本研究中采用乳化蒸發法制備達比加群酯中空微球,以期使制劑在胃液中長時間漂浮,延長釋藥時間,使藥物緩慢到達腸道,促進藥物在胃腸道的吸收。同時,主要對達比加群酯中空微球的制劑學基本性質進行了研究,現報道如下。

1 儀器與試藥

RW 20型電動攪拌器（德國IKA公司）；Agilent1100型HPLC（美國Agilent公司）；ZRS-8G型智能溶出試驗儀（天津大學無線電廠）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；S-3400N型掃描電鏡（日本Hitachi公司）。達比加群酯（上海灝云化工科技有限公司,純度大于99.0%,批號為13041527）；乙基纖維素（上海卡樂康包衣技術有限公司,10CP）；聚乙烯醇（PVA124,國藥集團化學試劑有限公司,進口分裝）；司盤80、二氯甲烷、無水乙醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 中空微球形成機理

在1991年Kawashima等[2]首次報道了中空微球給藥系統的制備,并步構思了中空微球的形成機理。中空微球的形成主要依靠有機溶劑二氯甲烷和乙醇。當骨架材料溶解在二氯甲烷和乙醇組成的混合溶劑中,加入到水溶液后則形成O/W的乳滴。由于乙醇為親水性有機溶劑,會快速擴散到水溶液中,同時使骨架材料析出、表面固化；而二氯甲烷為疏水性有機溶劑,則停留在微球的中心,隨著攪拌時間的延長,二氯甲烷則緩慢揮發而形成空腔[3]。

2.2 混合溶劑比例篩選

根據中空微球形成的機理設計驗證試驗。選擇乙醇與二氯甲烷之比為 10∶0,9∶1,5∶5,1∶9,0∶10 共 5 個比例來制備空白中空微球。將乙基纖維素0.6 g加入到無水乙醇與二氯甲烷的混合溶劑中,攪拌混勻后,緩慢滴加至含有吐溫80的聚乙烯醇溶液中,至有機溶劑揮發完全,物質形態見圖1。

圖1 乙醇與二氯甲烷不同比例制備的物質形態

可見,當主要用乙醇溶劑來制備中空微球時,由于乙醇為親水性溶劑,擴散到水溶液中,乙基纖維素會在水溶液中析出而變成絮狀沉淀。當主要用二氯甲烷來制備中空微球時,由于二氯甲烷為疏水性溶劑,擴散性差,可導致微球最后變成實心顆粒狀；當混合有機溶劑乙醇與二氯甲烷之比為5∶5時,親水溶劑乙醇先擴散至水溶液中,使表面骨架材料成圓形析出,然后疏水性溶劑二氯甲烷緩慢析出而形成空腔,所制備的中空微球具有非常明顯的空腔,球形較好。因此,親水溶劑和疏水溶劑的混合加入對于中空微球的形成至關重要。

2.3 達比加群酯中空微球制備

采用乳化蒸發法制備[3-4]。將乙基纖維素0.6 g與達比加群酯0.12 g（5∶1）加入到無水乙醇與二氯甲烷的混合溶劑（3mL∶3mL）中,攪拌混勻,然后緩慢滴加至含有 0.45%（g/mL）吐溫 80的30mL（1.5%）聚乙烯醇溶液中,以 210 r/min 轉速攪拌 2 h,至有機溶劑完全揮發,過80目篩收集,蒸餾水迅速蕩洗,真空干燥器中干燥24 h,干燥后篩選16～40 目（500～1000μm）粒徑的微球,備用[5]。

2.4 藥物含量測定建立

2.4.1 色譜條件[6]

色譜柱:Agilent C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)；流動相:0.2%的醋酸銨溶液（用冰醋酸調節 PH 至 4.4）-乙腈（50∶50）；檢測器:紫外檢測器；檢測波長:226 nm；柱溫:室溫；進樣量:20μL。

2.4.2 方法學考察

標準曲線繪制:精密吸取質量濃度分別為 10,20,40,60,80,100μg/mL的達比加群酯溶液 20μL,依法進樣。200～800 nm 紫外全波長掃描見圖2,可見,達比加群酯在乙腈溶劑中的最大吸收波長為226 nm,且空白微球在此波長處不干擾測定。在檢測波長226 nm下所得色譜圖見圖3。按擬訂的色譜條件測定峰面積,以對照品進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程 A=38.58C ＋4.123,r2=0.9999（n=6）。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μL,重復進樣5次,按擬訂的色譜條件進樣測定。結果對照品溶液和供試品溶液平均峰面積積分值的 RSD分別為1.52%和1.69%（n=5）。

回收率試驗:稱取空白微球10 mg,乙腈溶解,流動相定容于10 mL容量瓶中,精密吸取對照品溶液1mL置10mL容量瓶中,加空白微球溶液定容至刻度,搖勻,用0.45μm的微孔濾膜濾過,取20μL依法進樣測定。結果平均回收率為98.70%,RSD=1.83%。

2.4.3 含量測定

精密稱取制備的中空微球10 mg,置10 mL容量瓶中,甲醇溶解,搖勻,甲醇定容至刻度；移取 0.5 mL溶液,置10 mL容量瓶中,甲醇稀釋,搖勻,定容至刻度。采用高效液相色譜法測定并計算中空微球中達比加群酯的百分含量（mg/mg）。結果的藥物的百分含量為（11.18±0.05）% （n=3）。

2.5 主要制劑學性質考察

微球外觀形態觀察:取制得的粒徑為500～1000μm的空白中空微球、含藥中空微球,排列好后置銅片上噴金（15～20 nm）,置S-3400N型掃描電子顯微鏡以相同放大倍數觀察2種微球粒子的微觀形態,加速電壓設定為20 kV,結果見圖4。可見,空白中空微球表面較光滑,球形度較好,具有明顯的空腔,局部放大可見微小細孔；達比加群酯中空微球的表面附有較多顆粒狀物質,與空白中空微球（不含藥）對照,可以確定表面附著的物質為藥物；在中空微球球壁能看到許多細小空隙,應為氣體逃逸時所產生。中空結構的存在可使微球的密度低于胃液的密度,從而產生胃漂浮性能。

圖2 紫外全波長掃描圖

圖3 高效液相色譜圖

體外漂浮性能測定:取制得的微球100粒,置溶出度測定儀中進行漂浮性能測試,介質為人工胃液（pH=1.2）水溶液150mL。在溫度37℃、轉速50 r/min下攪拌,10 h后收集微球的漂浮部分和非漂浮部分。漂浮微球的漂浮力可通過公式計算[7]。P（%）=Sf÷100×100%。式中 F為漂浮百分率,Sf為10 h后漂浮微球的個數。經計算,10 h 后中空微球的漂浮百分率為（86.33 ±0.03）%（n=3）,表明在較長時間里達比加群酯中空微球的體外漂浮性能良好。

體外釋放度測定:按照2010年版《中國藥典（二部）》測定法中轉籃法測定。取粒徑為500～1000μm的中空微球適量（約含達比加群酯 22 mg）,置溶出度測定儀中,轉速為 100 r/min,以pH =1.2的人工胃液 900 mL 為釋放介質,溫度為（37±0.5）℃,于 0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0 h 時取樣5 mL,同時添加補液[8]。樣品溶液經 0.8μm微孔濾膜濾過,人工胃液稀釋后,于325 nm波長處測定吸光度（避免紫外測定中末端吸收）,紫外分光光度法計算（標準曲線為 A=0.043＋0.0201C,r2=0.998,線性范圍為 4～16 μg/mL）,以釋藥時間為橫坐標、累積釋藥百分率為縱坐標繪制體外釋藥曲線,結果見圖5。

圖4 中空微球的掃描電鏡圖

圖5 載藥微球累積釋藥曲線（n=3）

3 討論

達比加群酯口服經胃腸吸收后,在體內轉化為具有直接抗凝血活性的dabigatran。dabigatran結合于凝血酶的纖維蛋白特異結合位點,阻止纖維蛋白原裂解為纖維蛋白,從而阻斷了凝血瀑布網絡的最后步驟及血栓形成；還可從纖維蛋白-凝血酶結合體上解離,發揮可逆的抗凝作用。達比加群酯于2008年4月首次在德國和英國上市,2010年10月20日美國食品藥物管理局（FDA）批準其應用于非瓣膜性心房顫動患者腦卒中及全身血栓栓塞的預防,是繼華法林之后50年來上市的首個新類別口服抗凝血藥物[9]。與華法林相比,達比加群酯具有可口服、強效、無需特殊用藥監測、藥物相互作用少等優點[10]。針對深靜脈血栓的治療及一級預防,達比加群酯只需每日1次,大大增加了患者的依從性；但針對非瓣膜性心房顫動患者腦卒中及全身血栓栓塞的預防,則需2次/d[11],給藥至少3個月、6個月或12個月[12],降低了患者的順應性。因此,根據達比加群酯的性質,有必要研究開發適合其每日一次、可長期給藥的劑型,用以預防全身性血栓性疾病。

中空微球是一種帶有較大空腔的固體微球制劑,中空微球給藥系統被認為是胃漂浮給藥系統中最有前景的形式。由于中空微球可長時間漂浮在胃內,能夠用于治療局部胃部疾病或者延長藥物作用時間[13]。近年來,許多研究者對這種新制劑形式進行了研究和報道。Kawashima等[2]1991年首先報道了胃漂浮載藥中空微球的制備,主要制備方法為,首先采用乳化蒸發方法制備含有有機溶劑（乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙醚）的乳劑,然后蒸發有機溶劑,形成中空的微球。

達比加群酯為脂溶性藥物,在 PH =1.2的酸性環境溶解度最大,因此本試驗中制備的中空微球是可行的。利用中空微球可長時間漂浮在酸性胃液中的性質,可增加達比加群酯在胃中的溶解度,使藥物緩慢到達腸道而被吸收,從而提高藥物的生物利用度。在制備中空微球的過程中,將乙醇和二氯甲烷組成的混合溶劑加入到含吐溫80的聚乙烯醇溶液中,混合溶劑相當于油相,在聚乙烯醇溶液中乳化形成乳滴；后來由于溶劑的揮發,乙基纖維素和藥物析出,形成中空微球。該法制備的中空微球性質較穩定,方法簡單易行；中空微球在體外能長時間漂浮在液面,漂浮性能良好。但處方中應用了毒性較大的有機溶劑二氯甲烷,如何篩選更加安全的有機溶劑需要進一步研究。體外釋放行為考察結果表明,達比加群酯中空微球在pH=1.2的鹽酸溶液（釋放介質）中的釋放行為符合緩釋制劑的要求。

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