三黃桃葛膠囊中7種成分含量測定研究

葉家宏 ，段園園，申衛紅 ，黃月純

（1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405； 2.貴州省腫瘤醫院，貴州 貴陽 550003；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405)

三黃桃葛膠囊由黃芪、葛根、制大黃和地黃等中藥組方，具有清熱生津、益氣滋陰和活血化瘀的作用，適用于治療2型糖尿病氣陰兩虛夾瘀型患者。黃芪中黃酮類成分[1-2]，葛根中葛根素[3-4]，地黃中梓醇及寡糖[5-6]、大黃蒽醌[7-8]等成分，都具有不同程度的調節血糖，抑制胰島素抵抗和糖尿病狀態下異常的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的表達活性，增強胰島素敏感性，抑制腎上腺素和四氧嘧啶所致的小鼠的血糖升高，改善糖耐量，減少胰島素抵抗等作用。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法分別對三黃桃葛膠囊中葛根、制大黃及黃芪的主要成分進行含量測定，為其質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

HP 1100型高效液相色譜儀（Agilent公司）；二極管陣列檢測器（Agilent公司）；BP 211D 型電子天平（d＝0.01 mg，德國賽多利斯公司）；SK7200LHC型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）；TG16-WS型臺式高速離心機（湖南賽特湘儀離心機有限公司）。葛根素對照品（批號為110552-200741），毛蕊異黃酮苷對照品(批號為 110907)，大黃素對照品（批號為0756-9908），蘆薈大黃素對照品(批號為110795-200806)，大黃素甲醚對照品（批號為 110758-200610），大黃酸對照品(批號為 110757-2008206)，大黃酚對照品（批號為0756-9908），均購自中國藥品生物制品檢定所；三黃桃葛膠囊（批號分別為20120321，20120322，20120323，自制）；甲醇為色譜純（德國Merck公司），水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 葛根素含量測定

2.1.1 色譜條件[9]

色譜柱：Zorbax SB C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水，梯度洗脫，0～5 min甲醇為20%→25%，5～10 min甲醇為25%→30%，10～18 min甲醇為30%→30%，18～22 min甲醇為 30%→20%；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；柱溫：室溫。

2.1.2 溶液制備

取葛根素對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL含 77.2 μg的溶液，即得對照品溶液。取本品內容物約 0.1 g，精密稱定，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。另取缺葛根素的陰性對照品適量，同法制成陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.1.2項下 3種溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果陰性無干擾，見圖1。

線性關系考察：精密吸取葛根素對照品溶液 1，2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得葛根素回歸方 程 Y＝4 322.90 X-4.57，線 性 范 圍 為 0.077 ～1.54 μg(r＝0.999 9)。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液各5 μL，重復進樣6次，測定葛根素峰面積。結果的 RSD為 0.13%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液 5 μL，分別于 0，2，4，8，12，24 h時進樣，測定峰面積。結果的 RSD為 0.24%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取本品（批號20120321）內容物，依法平行制備6份供試品溶液，各進樣5μL。結果平均含量為 15.71 mg/g，RSD為0.23%，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的本品（批號為 20120321）內容物 6 份，每份約 0.05 g，精密稱定，分別精密加入葛根素對照品溶液，依法制備供試品溶液并進樣分析。結果見表1。

圖1 葛根素高效液相色譜圖

表1 葛根素加樣回收試驗結果(n＝6)

2.1.4 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標法計算含量，結果見表2。

表2 7種成分含量測定結果（mg/g）

2.2 5種蒽醌含量測定

2.2.1 色譜條件[9-10]

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇 -0.1%磷酸，梯度洗脫：0～13 min甲醇為82%→82%，13～24 min甲醇為82%→90%，24～30 min甲醇為90%→82% ；檢測波長：254 nm；流速：1 mL /min；柱溫：室溫。

2.2.2 溶液制備

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別制成每 1 mL含蘆薈大黃素 16.4 μg、大黃 酸 20.5 μg、大 黃 素 18.1 μg、大 黃 酚 17.4 μg，大 黃 素 甲 醚23.4 μg的混合溶液，作為對照品溶液。取本品內容物約 0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，加甲醇定容至5 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。另取缺大黃陰性對照品適量，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2.2 項下 3 種溶液各 10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結果陰性無干擾，見圖2。

線性關系考察：精密吸取蒽醌混合對照品溶液 1，2，5，10，20，30 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸。蘆薈大黃素回歸方程 為 Y＝4 483.28 X-0.29，線 性 范 圍 為 0.016 ～0.49 μg(r＝ 0.999 9)；大黃酸回歸方程 為 Y＝ 3 196.38 X-0.95，線 性 范 圍 為 0.020 ～ 0.61 μg(r＝ 0.999 9)；大黃素回歸方程 為 Y＝ 3 288.48 X-1.35，線 性 范 圍 為 0.018 ～ 0.54 μg(r＝ 0.999 9)；大黃酚回歸方程 為 Y＝4 351.54 X-3.10，線 性 范 圍 為 0.017 ～0.52 μg(r＝0.999 9)；大黃素甲醚回歸方程為 Y＝ 2 056.37 X-2.47，線性范圍為 0.023 ～ 0.70 μg(r＝ 0.999 9)。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液各10 μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸平均峰面積的 RSD分別為 0.29%，1.21%，0.68%，0.93% ，0.38% ，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣，測定峰面積。結果表明，大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸平均峰面積的 RSD分別為0.15% ，0.91% ，0.45% ，0.76% ，0.33% ，表明 5 種游離蒽醌在24 h內較穩定。

重復性試驗：取本品（批號為20120321）內容物，依法平行制備6份供試品溶液，各進樣10 μL。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為 0.108，0.376，0.104，0.279，0.071 mg/g，RSD 均小于 1.55%，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的本品（批號為20120321）內容物 6份，每份約 0.25 g，精密稱定，分別精密加入一定量的蒽醌混合對照品溶液，依法制備供試品溶液并進樣分析。結果見表3。

2.2.4 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標法計算含量。結果見表2。

圖2 5種游離蒽醌高效液相色譜圖

2.3 毛蕊異黃酮苷含量測定

2.3.1 色譜條件[10]

色譜柱：Zorbax SB-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5%甲酸溶液，梯度洗脫，0～15 min甲醇為25%→25%，15～30 min甲醇為25%→40%，30～35 min甲醇為40%→70%，35～45 min甲醇為70%→70%，45～55 min甲醇為70%→25% ；檢測波長：260 nm；流速：1 mL /min；柱溫：室溫。

2.3.2 溶液制備

取毛蕊異黃酮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含 57.2 μg 的溶液，即得對照品溶液。取本品內容物約 0.8 g，精密稱定，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。另取缺黃芪陰性對照品適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.3.2項下3種溶液各 5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結果陰性無干擾，見圖3。

線性關系考察：精密吸取毛蕊異黃酮苷對照品溶液1，2，5，10，15，20，30 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得毛蕊異 黃酮苷 的 回歸方程 Y＝3 755.04 X-3.92，線性范 圍 為0.057 ～ 1.72 μg(r＝ 0.999 9)。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液各5 μL，重復進樣6次，測定毛蕊異黃酮苷峰面積。結果的 RSD為0.23%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液 5 μL，分別于 0，2，4，8，12，24 h時進樣，測定峰面積。結果的 RSD為 0.34%，表明供試品溶液在24 h內較穩定。

重復性試驗：取本品（批號為 20120321）內容物，依法平行制備6份供試品溶液，各進樣 5 μL。結果平均含量為0.316 mg /g， RSD 為 0.26% ，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的本品（批號為20120321）內容物 6份，每份約 0.4 g，精密稱定，分別精密加入一定量的毛蕊異黃酮苷對照品溶液，依法制備供試品溶液并進樣分析。結果見表4。

表3 5個游離蒽醌加樣回收試驗結果(n＝6)

圖3 毛蕊異黃酮苷高效液相色譜圖

表4 毛蕊異黃酮苷加樣回收試驗結果(n＝6)

2.3.4 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標法計算含量。結果見表2。

3 討論

葛根素含量測定色譜條件采用2010年版《中國藥典(一部)》葛根項下方法[9]，結果葛根素色譜峰分離效果不佳，通過調整流動相比例，獲得較好的分離效果。大黃游離蒽醌含量測定方法參考2010年版《中國藥典(一部)》大黃項下方法[9]，參考文獻[10]對流動相比例進行了優化。由于制劑中毛蕊異黃酮苷含量較低，色譜條件對毛蕊異黃酮苷色譜峰的分離效果影響較大。通過對不同色譜柱 Zorbax SB-C18，Nucleodμr C18Gravity，Kromasil 100-5 C18以及不同流動相系統乙腈-0.2%甲酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇 -0.5%甲酸的不同梯度進行篩選，確定了色譜柱為 Zorbax SB-C18柱，流動相為甲醇-0.5%甲酸梯度洗脫系統。

葛根素、大黃5種游離蒽醌、毛蕊異黃酮苷的供試品溶液制備參考《中國藥典》中方法，經試驗采用60%甲醇為溶劑提取葛根素、毛蕊異黃酮苷，甲醇為溶劑提取蒽醌效果較好，采用了超聲處理20，30，40 min，結果超聲處理30 min即提取完全。

本研究中建立的7種成分含量測定方法經方法學考察，方法準確、簡便、專屬性強，為三黃桃葛膠囊質量控制提供了參考。

參考文獻：

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