MicroRNA－181a對人宮頸癌細胞的鉑類藥物敏感性的調節作用

李巧云

（河北省唐山市婦幼保健院婦科，河北 唐山 063000）

鱗狀細胞癌是宮頸癌最主要的病理類型，占80% ～85%[1]。目前，化學治療（簡稱化療）是治療宮頸癌的重要手段，以鉑類為基礎的化療結合放射治療(簡稱放療)是治療原位晚期宮頸癌的主要方法。但近年來發現，許多晚期宮頸癌患者在治療過程中逐漸產生對化療藥物的耐藥性，導致治療失敗。因此，對化療藥物耐藥性的研究已成為宮頸癌患者治療的熱點。microRNA（miRNA）是一種短鏈非編碼RNA，是重要的轉錄后調控因子[2]。近幾年的研究已經證明，miRNA同多種腫瘤的化療耐藥性有關，影響藥物的傳遞與代謝[3]。故推論miR－181a的上調表達或許也同宮頸癌細胞化療藥物的耐藥性相關。本研究中分析了miR－181a在人宮頸鱗狀細胞癌細胞系及裸鼠移植瘤模型中的功能及其對化療藥物敏感性的影響，為提高宮頸癌的藥物治療提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料

病例與腫瘤標本：腫瘤標本取自70例經組織病理學診斷為宮頸鱗狀細胞癌Ⅲb期的患者，此前未進行過化療，患者全身情況良好，無嚴重的器官功能不全，未合并其他器官／血液的惡性腫瘤。入院后對研究對象采用標準化療方案，每周40 mg／m2順鉑，在完成化療6個月后，進行組織病理學診斷，如果腫瘤壞死大于50%為敏感，否則認為腫瘤對藥物不敏感（耐藥）。共有75例患者符合研究要求，其中9例對化療藥物有耐藥性。所有標本貯存溫度為－80℃。用于組織病理學診斷的組織至少包含70%的腫瘤細胞。在取標本前，所有患者均簽署知情同意書。

細胞系與小鼠：SiHa與Me180人宮頸癌細胞系（購自中國典型培養物保藏中心），培養于含10%胎牛血清的Egale′s Minimum Essential（EMEM）培養基或 McCoy′s 5a改良培養基，加入適量抗生素，培養在 37℃、5%CO2的培養箱中。雌性 BALB／c裸鼠（4～6周齡），購自河北醫科大學動物實驗中心，飼養在無病原菌房間內。試驗期間動物管理符合國家動物管理條例，所有試驗均經醫院倫理委員會批準。

1．2 試驗方法

RNA提取與實時定量聚合酶鏈式反應：將病理標本送至上海生物科技公司，病理標本中的RNA提取采用凱基miRNA抽取試劑盒（批號為217004），用安捷倫公司miRNA微陣列芯片分析基因譜，具體方法參照試劑盒說明書。細胞中的總RNA提取采用Trizol法，用 Prime Script RT試劑盒（TaKaRa，中國大連），根據試劑盒說明書進行反轉錄。SYBR Premxi Ex Taq用于實時定量PCR試驗。用特異性引物對RNA進行反轉錄。TaqMan探針檢測miRNA的表達。采用U6核小RNA（美國AB公司）為內參進行均一化。

質粒轉染：miR－181a抑制因子－PRKCD干擾 RNA（siRNA）及陰性質粒作為非特異性對照，其miRNA／siRNA由Gene Pharma（中國上海）合成。miR－181a抑制因子為序列特異、最優化的單鏈RNA分子，靶向互補于目的RNA，從而下調相關靶向分子表達。hsa－miR －181a序列為 5′ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU －3′，抑制因子 NC 序列為 5′－CAGUACUUUUGUGUAGUACAA －3′。siPRKCD敲除PRKCD miRNA與蛋白質的表達，Me180或SiHa細胞種植于 6孔板中（2×105個細胞 ／孔），用 Lipofectamine2000（Invitrogen公司）試劑轉染，miRNA與 siRNA轉染量為100 pmol，具體操作方法根據試劑盒說明書進行轉染，時間為48 h。為了分析 miR－181a與 PRKCD對宮頸癌細胞系的影響，將幾個不同miRNA序列構建到載體中，建立穩定轉染 Me180與 SiHa細胞系，最后用 qRT－PCR與 Western blot檢測穩定轉染細胞系中miR－181a或PRKCD的表達。

CCK－8試驗分析細胞的活性：用 Cell Counting Kit（CCK－8）試劑盒（Dojindo，中國上海）分析SiHa與 Me180的細胞活性。直接或轉染后48 h，將細胞種植于96孔板中（5×103個細胞／孔）。孵育過夜后，加入新鮮配制好的不同濃度的化療藥物，例如順鉑或吉西他濱（Sigma公司）。細胞用藥處理48 h后，加入正常培養基，含有WST－8底物，37℃孵育2 h。隨后，細胞活力用分光光度計，在450 nm波長下測定吸光度值。

體內化療敏感性試驗：穩定轉染miR－181a表達載體或陰性對照載體（2×106個細胞 ／老鼠）的Me180細胞收集后，皮下注射到6周齡BALB／c裸鼠（每組7只）右側背部。每隔2周測量1次腫瘤體積，腫瘤體積計算公式，V（mm3)＝A×B2／2，A為最大直徑，B為垂直直徑。在14 d時，腫瘤體積最大直徑約為8 mm，體積為100 mm3，表達 miR－181a或對照載體細胞的荷瘤小鼠，隨機分成兩組。一組每周皮下注射5 mg／kg順鉑，共4次。另一組以0．9%氯化鈉注射液作為對照。

1．3 統計學處理

2 結果

2．1 病理標本篩選結果

共對5例化療敏感與5例化療不敏感(耐藥)的腫瘤樣本進行了RNA mircoarray基因譜的分析與篩選，這10例患者的臨床特點、病理分期均相近，當兩組差異表達數超過2倍且 P＜0．05時，結果有意義。結果顯示，化療敏感的腫瘤miR－181a表達下調（圖 1)，P ＝0．021。

圖1 基因分析miR－181a在化療耐藥與敏感患者組織中的表達

2．2 宮頸癌細胞系中miR－181a表達與藥物敏感性的關系

在宮頸癌細胞系SiHa與Me180中，發現miR－181a表達量同化療敏感性呈反比關系。由圖2 A可見，Me180細胞miR－181a的表達量比SiHa低65%，Me180對順鉑與吉西他濱比SiHa要敏感（圖 2 B及圖 2 C）。說明 miR－181a表達在有化療耐藥性的腫瘤樣本比化療敏感的樣本顯著升高。

為提高監測系統續航能力,電源采用鋰電池結合太陽能充電形式[7],同時為防止陰天太陽能無法給電池充電造成鋰電池供電不足,預留了外電源接口,設計了電源切換電路。電源切換電路原理圖如圖3所示。當外部電源供電時MOS管原極為高電平,MOS管無法導通,鋰電池供電被切斷,反之由鋰電池供電。在鋰電池接口處加了二極管防止外電源電流灌入鋰電池中。

圖2 有化療耐藥性的宮頸鱗狀細胞癌中miR－181a高表達

2．3 miR－181a過表達在體內、體外對順鉑耐藥性的作用

為了分析miR－181a的表達對腫瘤細胞藥物敏感性的影響，用穩定轉染 miR－181a或陰性質粒的 Me180細胞，以及轉染miR－181a抑制因子或陰性對照miRNA的SiHa細胞進行研究。結果表明，上調 miR－181a的表達，增加了Me180細胞的耐藥性；而用miR－181a抑制因子轉染SiHa細胞后，增強了其對順鉑的敏感性。體外試驗結果也表明，miR－181a表達增加，腫瘤細胞化療耐藥性增強（圖3 A）。動物試驗證實，miR－181a增強了化療耐藥性。由圖3 B至圖3 D可見，腫瘤在有或無miR－81a的情況下，在無化療藥物處理時，生長情況類似，體積與瘤重大致相等。當用順鉑處理后，miR－181a的增強表達顯著促進了腫瘤體積與瘤重的增加，表明miR－181a的上調表達，增強了體內宮頸癌細胞的化療耐藥性。

3 討論

宮頸癌為我國女性患者一種常見腫瘤，但不同患者對化療藥物的反應不同，表現為接受相關劑量的藥物后產生不同的生物學效應，如腫瘤的生長與縮小程度等，這一過程受到多種因素的影響，是目前抗癌治療中的研究熱點問題。本研究中通過比較化療敏感與化療耐藥性患者miRNA微陣列譜的差異，了解人宮頸鱗狀細胞癌化療耐藥性的生物學機制，以找到可解決腫瘤化療耐藥性的治療方式。國外相關研究發現，miR－378，miR－181a，miR－21，miR－221可能同化療耐藥性有關[4]。本研究主要研究了其中最為重要的miR－181a，結果發現，該miRNA在有化療耐藥性的宮頸癌細胞中高表達。所以推論，miR－181a是一種宮頸癌化療耐藥性的關鍵因子。為進一步了解宮頸癌與化療敏感性的關系，試驗中選擇了2種宮頸癌細胞，通過克隆轉染技術及PCR檢測這2種細胞中的miR－181a的表達。結果證實了此結論，即在有藥物耐藥性的SiHa細胞中miR－181a高表達，而對化療藥物敏感的Me180細胞中miR－181a明顯降低，這同人體的病理標本結論是一致的。通過基因轉染技術發現，在轉染miR－181a后腫瘤細胞對藥物敏感明顯下降，而轉染其抑制因子后敏感性升高；裸鼠模型也顯示轉染了miR－181a后，腫瘤對藥物的反應不敏感，體積與瘤重明顯增加，從而在體內外試驗中都證實了miR－181a能抑制腫瘤對化療藥物的敏感。

圖3 體外與體內miR－181a對宮頸癌細胞化療藥物敏感性的影響

尋找腫瘤特異的miRNA分子，以及他們的靶基因，是了解miRNA在腫瘤產生過程作用機制的關鍵，也是一種新的腫瘤治療靶點[5]。miR－181a既可作為原癌基因，也可作為腫瘤抑制因子。miR－181a可以下調癌基因RalA的表達，促進細胞凋亡，并抑制慢性骨髓性白血病的發展[6]。同時，miR－181a也是影響治療反應的一種介導因子。在A549非小細胞肺癌細胞系中，miR－181a能減少順鉑誘導的細胞凋亡[7]。這些發現同miR－181a參與調控線粒體或后線粒體內源性凋亡途徑有關，包括caspase－3／9蛋白成熟、線粒體跨膜勢能的消失及Bax的寡聚化[8]。本研究證明了異源表達miR－181a表達能夠增加宮頸鱗狀細胞癌在體內／外的化療耐藥性。據此可認為，miR－181a能作為原癌基因增強人宮頸癌鱗狀細胞化療耐藥性。子宮內膜表達miR－181a影響了許多子宮內膜細胞的活動，并參與子宮內膜細胞從正常狀態向腫瘤狀態的改變過程[9]。

對于miR－181a增強耐藥性的研究，目前一般認為是通過降低PRKCD的表達來實現的。試驗證明，PRKCD是miR－181a一種可能的靶基因，miR－181a通過靶向于PRKCD的3′－UTR區，負調控PRKCD mRNA與蛋白質的表達，PRKCD在調控化療敏感性中發揮作用，穩定表達PRKCD mRNA與蛋白的SiHa細胞，對順鉑更敏感。當轉染PRKCD表達載體后，抑制了miR－181a的作用，恢復了腫瘤細胞對化療的敏感性[10]。這些研究證實，miR－181a在調控腫瘤細胞化療耐藥性中功能與機制的協調作用。目前，基因治療是腫瘤治療過程的一個重要方法，得到了越來越多的認可，miRNA可成為腫瘤治療一個重要方面，在宮頸癌的治療中，如能成功導入化療敏感性的miRNA或去掉產生耐藥性的miRNA（miR－181a）將極大地改善晚期宮頸癌的預后，同時降低藥物的劑量，減少不良反應。

本研究發現，在人宮頸癌細胞中miR－181a的異常表達對化療敏感性有影響，miR－181a是一種通過靶向于PRKCD的化療耐藥性增強因子[11]。故 miR－181a－PRKCD的相互作用或許可以作為標志物來預測宮頸鱗狀細胞癌對順鉑的化療敏感性。

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