胡椒堿對(duì)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF－7／ADM細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用

賴 艷，溫 悅，盧來(lái)春

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶 400042）

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致腫瘤患者化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱化療）失敗的主要原因之一，其中由MDR1基因編碼的P－糖蛋白（P－gp)的過(guò)度表達(dá)是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的主要原因[1－2]。逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，恢復(fù)其對(duì)化療藥物的敏感性是目前研究的重點(diǎn)。胡椒堿是從黑胡椒和篳茇中提取的植物生物堿，近年來(lái)其抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗驚厥和免疫調(diào)節(jié)等生物活性廣受重視。本研究中就胡椒堿對(duì)人乳腺癌阿霉素(ADM)耐藥細(xì)胞株MCF－7／ADM細(xì)胞的增殖情況的影響進(jìn)行了觀察，探討胡椒堿對(duì) MCF－7／ADM細(xì)胞上 P－gp的表達(dá)影響，為闡述胡椒堿逆轉(zhuǎn) MCF－7／ADM細(xì)胞可能的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 主要試藥與儀器

胡椒堿(純度大于98%，成都曼思特公司生物科技有限公司)；阿霉素（ADM，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，規(guī)格為 10 mg）；CCK－8試劑盒(Cell Counting Kit－8，碧云天公司）；兔抗人 P－gp（一抗）及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（二抗）購(gòu)自北京博奧森生物有限公司；兔抗鼠β－actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。凝膠電泳儀、垂直電泳槽、蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)印儀均購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF－7／ADM購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。MCF－7／ADM細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1 000 ng／mL ADM、100 U ／mL 青霉素、100 μg／mL 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中(添加ADM以維持細(xì)胞的耐藥性)。細(xì)胞置37℃及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。試驗(yàn)前2周將MCF－7／ADM細(xì)胞撤藥，置不含 ADM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有試驗(yàn)均選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行。

1．3 試驗(yàn)方法

對(duì) MCF－7／ADM細(xì)胞的毒性作用(CCK－8法檢測(cè))：較MCF－7／ADM細(xì)胞，按5 000個(gè) ／孔接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后即可加藥，設(shè)試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組。試驗(yàn)組加入不同梯度濃度的胡椒堿，每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL的CCK－8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)光密度(OD)值。取3個(gè)孔的平均 OD值，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率（LCS）及細(xì)胞抑制率（IR），LCS(%)＝(試驗(yàn)組 OD值－空白組 OD值)／(對(duì)照組 OD值－空白組 OD值)×100%。IR(%)＝1－LCS。

對(duì) MCF－7／ADM細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用(CCK－8法檢測(cè))：試驗(yàn)分為4組。對(duì)照組為MCF－7／ADM細(xì)胞（未加藥物)；試驗(yàn)組則根據(jù)選定的胡椒堿無(wú)毒濃度，設(shè)定高、中、低3個(gè)濃度的胡椒堿和MCF－7／ADM細(xì)胞共同培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為 200 μL。培養(yǎng) 48 h 后，每孔加入 20 μL 的 CCK － 8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度(OD)值，試驗(yàn)重復(fù)5次，取其平均值，檢測(cè)胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。計(jì)算出半數(shù)抑制率的ADM質(zhì)量濃度(IC50)。細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝對(duì)照組細(xì)胞 IC50／試驗(yàn)組細(xì)胞 IC50。取3個(gè)孔的 OD值均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞存活率（LCS）及細(xì)胞抑制率（IR）。

對(duì) MCF－7／ADM細(xì)胞 P－gp表達(dá)的影響(Western－blot法檢測(cè))：收集與胡椒堿共同培養(yǎng)48 h的MCF－7／ADM細(xì)胞，抽提總蛋白，以 β－actin為內(nèi)參，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析。總蛋白100℃高溫變性后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳;凝膠濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，100 V電壓條件下電轉(zhuǎn)移60 min；置10%脫脂奶粉 TBST緩沖液中，室溫平搖2 h進(jìn)行封閉；以 β－actin一抗(1 ∶500)及 P －gp一抗（1∶500）稀釋，4℃孵育過(guò)夜后漂洗，與羊抗人 IgG(1 ∶5 000)、羊抗鼠（1 ∶5 000）室溫下孵育 1 h，漂洗后ECL顯像，每組至少重復(fù)3次試驗(yàn)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，兩樣本間均數(shù)比較采用 t檢驗(yàn)。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞無(wú)毒劑量的篩選

胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞無(wú)毒劑量的篩選，是盡量減少胡椒堿本身的細(xì)胞毒作用，胡椒堿的無(wú)毒劑量范圍應(yīng)設(shè)定為抑制率低于10%。胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞無(wú)毒劑量篩選結(jié)果為120 μmol／L。

2．2 胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞均有一定程度的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，且無(wú)毒劑量范圍是60～100 μmol／L，逆轉(zhuǎn)作用隨著胡椒堿濃度的升高而增加，見(jiàn)表 1 。60，80，100 μmol／L胡椒堿試驗(yàn)組細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為 1．62，2．08，3．78 倍，呈濃度依賴性（P ＜0．05），見(jiàn)表 2。

表1 不同濃度胡椒堿作用48 h后ADM對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞存活率影響的變化（%，n＝3）

表2 不同濃度胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

2．3 Western－blot試驗(yàn)結(jié)果

加入不同濃度胡椒堿和MCF－7／ADM細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h后，隨著胡椒堿濃度的增加，P－gp蛋白所在條帶灰度依次減弱，見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，隨著胡椒堿濃度的增加，MCF－7／ADM細(xì)胞表面的P－gp表達(dá)量逐漸減少。

圖1 胡椒堿對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞中P－gp蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物毒性損傷最重要的自我保護(hù)性防御機(jī)制。其發(fā)生是多階段、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，增加腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，提高腫瘤化療的效果，有著重要的臨床意義。目前，對(duì)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的研究主要集中在其發(fā)生的機(jī)制、逆轉(zhuǎn)藥物的尋找和多藥耐藥逆轉(zhuǎn)方法的開(kāi)發(fā)等幾個(gè)方面，尋找并開(kāi)發(fā)高效、低毒、能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物是目前研究的重要課題[3－4]。

胡椒堿具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗驚厥和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5－7]。細(xì)胞試驗(yàn)表明，與胡椒堿短期接觸有可能抑制腸道上皮細(xì)胞P－gp的功能[8]，而P－gp的高表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤多藥耐藥的主要原因。胡椒堿是否逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性，至今未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，值得深入研究。

本研究中選擇乳腺癌多藥耐藥的MCF－7／ADM細(xì)胞，考察了在無(wú)毒劑量范圍內(nèi)胡椒堿和阿霉素聯(lián)用對(duì)MCF－7／ADM細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果表明，在 60～1 500 μmol／L的濃度范圍內(nèi)，隨著胡椒堿濃度的升高逆轉(zhuǎn)作用增強(qiáng)；60，80，100μmol／L胡椒堿試驗(yàn)組細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為 1．62，2．08，3．78 倍，呈濃度依賴性；Western－blot結(jié)果表明，胡椒堿能降低P－gp的表達(dá)水平，并呈劑量依耐性。因此推斷，胡椒堿可能通過(guò)抑制P－gp的表達(dá)，提高藥物在細(xì)胞內(nèi)的聚集，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，從而發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞的作用。

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