低溫聯(lián)合腺苷預(yù)處理對脊髓缺血－再灌注的保護作用

曾 燕

（邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院藥劑科，湖南 邵陽 422000）

外科胸腹部大血管手術(shù)后，由于缺血－再灌注引起的脊髓損傷仍存在較高風(fēng)險[1－2]。如何預(yù)防和治療圍手術(shù)期的脊髓缺血－再灌注損傷已成為研究的重要課題。目前，低溫已廣泛應(yīng)用于外科大血管手術(shù)中中樞神經(jīng)組織的保護[3－4]，也是簡單、有效的神經(jīng)保護措施。腺苷是腺嘌呤核苷酸的代謝產(chǎn)物，普遍分布在細胞內(nèi)外。Koichi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腺苷可通過促進神經(jīng)元突起生長和神經(jīng)再生而對脊髓損傷起保護作用。但低溫聯(lián)合腺苷治療脊髓損傷的報道極少，其具體的作用機制也尚不清楚。本研究通過建立大鼠脊髓缺血－再灌注模型，用低溫聯(lián)合腺苷的處理方法，觀察其是否對脊髓缺血－再灌注損傷有保護作用，以及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物及分組：選擇成年健康雄性SD大鼠27只，SPF級，體重（200±20）g，由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號為湘醫(yī)動字D20－013號，室溫18～20℃，濕度65% ～70%，均自由飲水進食。隨機分為3組，各9只。低溫處理組(A組)，腹主動脈阻斷90 min，術(shù)中全身低溫18℃維持；常溫腺苷手術(shù)組(B組)，夾閉前 10 min尾靜脈注射腺苷，劑量為 0．06 mL／100 g，質(zhì)量濃度為5 g／L，腹主動脈阻斷 90 min；腺苷 ＋低溫18℃處理組(C組)，分離腹主動脈，夾閉前10 min尾靜脈注射腺苷，劑量為0．06 mL ／100 g，質(zhì)量濃度為 5 g／L，至 18 ℃ 維持，腹主動脈阻斷90 min。

主要材料：抗兔 Caspase－12、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP－78）抗體（Abcam公司），免疫組化試劑盒；TUNEL試劑盒。

1．2 試驗方法

大鼠脊髓缺血－再灌注模型建立：腹腔注射（每100 g體重0．3 mL）10%水合氯醛麻醉大鼠成功后，仰臥位固定于試驗臺上，腹部備皮消毒切開，于左腎動脈分叉下鈍性分離并顯露出近端1 cm腹主動脈，左右髂總動脈分叉上鈍性分離并顯露遠端1 cm腹主動脈，尾靜脈注射（每 100 g體重0．1 mL）肝素（濃度為500 U／mL）5 min后，用小號無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈近端及遠端，夾閉90 min后松開動脈夾行再灌注，縫合切口。

溫度監(jiān)測：用數(shù)字式電子肛溫計監(jiān)測大鼠肛溫。手術(shù)過程中以普通100 W燈泡照射保溫，使肛溫維持在37℃左右。低溫處理組分離腹主動脈后用自制冰盒降溫將大鼠肛溫降至18℃，阻斷90 min內(nèi)維持18℃，松夾后用普通100 W燈泡照射復(fù)溫至37℃左右。

脊髓組織取材：預(yù)定時間點，一部分大鼠在麻醉下開胸暴露心臟，剪開左心室插入灌注針頭至升主動脈，用止血鉗固定，剪開右心房，快速灌注生理鹽水(室溫)100～150 mL，待血液沖洗干凈后(肝臟變白)，即灌注 4%多聚甲醛（4℃）500 mL。背部備皮，將皮膚剪開，用咬骨鉗將棘突咬掉，暴露脊髓，取出腰骶段脊髓，行石蠟包埋，常規(guī)HE染色。

運動功能評分：由2名不了解分組情況的觀察者評估和記錄評分，每例均測試3次，取其平均值，分別于再灌注后6，24，48 h評估動物后肢運動狀況。參照改良Tarlov標(biāo)準(zhǔn)對神經(jīng)功能進行評分，0級為后肢無活動，不能負重；1級為后肢可見活動，但不能負重；2級為后肢活動頻繁或有力，不能負重；3級為后肢可支持體重，能走1～2步；4級為可行走，僅有輕度障礙；5級為行走功能正常。

免疫組織化學(xué)顯色：石蠟切片3%H2O2室溫90 s，正常動物血清封閉 20 min，1∶200兔抗鼠 Caspase－12孵育過夜，4℃；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃，2 h；鏈霉素－親和素－過氧化物酶復(fù)合物(SABC 復(fù)合物)，37℃，1 h；每次換液前均用 0．01 mol／L PBS沖洗5 min×3次，DAB加硫酸鎳顯色，常規(guī)脫水，封片。陽性細胞為紫藍色，光鏡下觀察，計錄陽性細胞的數(shù)量；并用圖像分析系統(tǒng)(成都金盤多媒體圖像處理系統(tǒng))測量陽性細胞的平均光密度值。

TUNEL染色：石蠟切片蛋白酶K消化60 min，3%H2O2－甲醇液50 μL 阻斷內(nèi)源型過氧化物酶，室溫 10 min；0．1%TritonX －100冰浴 5 min；TUNEL 反應(yīng)液 50 μL，37 ℃消化 60 min； POD 50 μL；每次換液前均用PBS沖洗5 min×3次；DAB加硫酸鎳顯色，脫水，封片。凋亡神經(jīng)細胞核呈深淺不一的紫黑色顆粒狀。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 HE 染色

經(jīng)常規(guī)HE染色后，各組均可見凋亡細胞，尤以常溫手術(shù)對照組為甚，凋亡細胞核濃縮碎裂，染色加深，大小不一致，或呈現(xiàn)大小不等的圓形小體，并被細胞膜包繞，即凋亡小體，有或無胞質(zhì)濃縮。A組神經(jīng)元腫脹，胞漿淡染，局部充血水腫，尼氏體淡染，排列紊亂；B組、C組神經(jīng)元改變較A組輕；C組神經(jīng)元有一定程度損傷，但較B組明顯減輕，充血和水腫也減輕，尼氏體排列較規(guī)則。

2．2 行為學(xué)評分結(jié)果

分別對各組大鼠再灌注6，12，24 h的后肢運動功能進行評分。與A組相比，B組、C組各時間點后肢功能評分降低幅度減少（P＜0．01）；相對于 B組，C組各時間點術(shù)后評分明顯增高（P ＜ 0．01）。見表 1。

2．3 TUNEL 染色結(jié)果

各組均出現(xiàn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞調(diào)亡，細胞核呈深蘭色，神經(jīng)元呈圓形或三角形，主要分布于前角和中央管周圍，部分細胞可見核固縮，深染，位于細胞一側(cè)；神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡分布廣泛，但主要位于鄰近灰質(zhì)的白質(zhì)部分。再灌注后，B組、C組凋亡細胞少于A組，且B組凋亡細胞數(shù)多于C組。

表1 3組 Tarlov評分結(jié)果(，分，n＝9)

表1 3組 Tarlov評分結(jié)果(，分，n＝9)

注：與A組同時點比較， P＜0．01；與B組同時點比較，＃P＜0．01。

組別A組B組C組術(shù)前5．0 5．0 5．0術(shù)后6 h 0．18 ± 0．15＃1．12 ± 0．13 1．55 ±0．12 ＃12 h 0．78 ± 0．13＃1．65 ± 0．11 2．01 ±0．05 ＃24 h 1．53 ± 0．05＃2．17 ± 0．01 2．56 ±0．18 ＃

2．4 免疫組織化學(xué)

在光鏡下觀察，陰性對照未見細胞染色。各組在脊髓缺血再灌注后均有神經(jīng)元 Caspase－12和GRP－78表達，A組脊髓Caspase－12陽性表達明顯增多，著色更深；B組陽性細胞表達減少，C組僅有少量陽性神經(jīng)元表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；A組脊髓GRP－78陽性表達較B組、C組少，著色淺；C組陽性表達高于 B組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表2。

表2 大鼠脊髓缺血－再灌注后免疫組織化學(xué)變化結(jié)果（，n＝9）

表2 大鼠脊髓缺血－再灌注后免疫組織化學(xué)變化結(jié)果（，n＝9）

注：與 A 組比較， P ＜0．05；與 B 組比較，＃P ＜0．05。

項目平均光密度值積分光密度值組別A組B組C組A組B組C組Caspase－12 0．42 ± 0．10＃0．31 ± 0．12 0．14 ±0．08 ＃238．11 ± 113．26＃176．35 ± 25．27 86．65 ±43．56 ＃GRP－78 0．15 ± 0．01＃0．46 ± 0．13 0．61 ±0．32 ＃98．65 ± 25．12＃252．18 ± 33．14 425．64 ±85．32 ＃

3 討論

脊髓缺血損傷形式有2種，即瞬時的損傷和延遲的損傷，前者常常是由于急性的缺血損傷所造成的神經(jīng)細胞壞死，后者則多是由于細胞凋亡所引起[6]。GRP－78是細胞為了適應(yīng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）所產(chǎn)生的一類應(yīng)激蛋白，屬于HSP70基因家族，其生理功能是協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配。Caspase－12是caspase家族中第1個被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的蛋白，是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡的關(guān)鍵因子。目前已有研究報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡而參與腦和脊髓缺血－再灌注損傷[7]。腺苷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸傳遞和神經(jīng)元活動的重要抑制性調(diào)節(jié)因子之一，體外腺苷發(fā)揮作用可通過受體、轉(zhuǎn)運進入細胞2種形式。研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用腺苷受體激動劑能改善脊髓缺血－再灌注損傷[8]。近年來有文獻報道，低溫能減少Caspase－12蛋白在缺血梗死區(qū)域的編碼表達[9]。且藥物與低溫聯(lián)合應(yīng)用可能會比單獨用藥效果更好[10－11]。以上現(xiàn)象提示，低溫可能加強了藥物的保護效果或者拓寬了藥物的治療范圍[12]。

本試驗HE染色結(jié)果顯示，B組、C組大鼠脊髓缺血再－灌注損傷后的局部缺損區(qū)域，缺血壞死等改變比A組輕，且C組改變比B組輕，細胞殘留數(shù)目增多，形態(tài)大致正常；行為學(xué)評分結(jié)果顯示，各組時間點，B組、C組高于A組，且 B組低于 C組；TUNEL染色結(jié)果顯示，再灌注后，B組、C組凋亡細胞少于A組，且B組凋亡細胞數(shù)多于C組，提示低溫聯(lián)合腺苷對脊髓神經(jīng)細胞缺血－再灌注損傷有保護作用，且比單獨應(yīng)用低溫或腺苷更有效。

本試驗免疫組化結(jié)果顯示，各組在脊髓缺血－再灌注后均有神經(jīng)元 Caspase－12和 GRP－78表達，A組脊髓 Caspase－12陽性表達明顯增多，著色更深；B組陽性細胞表達減少，C組僅有少量陽性神經(jīng)元表達；A組脊髓 GRP－78陽性表達較 B組、C組少，著色淺；C組陽性表達高于B組。說明在脊髓缺血－再灌注中低溫聯(lián)合腺苷保護作用的機制可能是通過降低Caspase－12和上調(diào)GRP－78的表達來減少脊髓神經(jīng)組織的損傷。

綜上所述，本試驗證實了低溫聯(lián)合腺苷對于脊髓缺血－再灌注損傷有保護作用，并且低溫可能加強了腺苷的保護效果，其可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而實現(xiàn)對脊髓神經(jīng)組織的保護。進一步證實了低溫結(jié)合藥物是一種更有效的治療方法，為治療脊髓缺血－再灌注損傷提供了新的治療途徑，但其具體的分子作用機制及臨床應(yīng)用仍有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Estrera AL，Miller CC，Huynh TT，et al．Preoperative and operative predictors of delayed neurologic deficit following repair of thoracoabdominal aortic aneurysm[J]．J Thorac Cardiovasc Surg，2003，126:1 288 － 1 294．

[2]Conrad MF，Crawford RS，Davison JK，et al．Thoracoabdominal aneurysm repair:a20 － yearperspective[J]．AnnThorac Surg，2007，83:S865 － S861．

[3]程 強，冉 毅，霍建宏，等．神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合亞低溫治療重型顱腦損傷 60 例[J]．中國藥業(yè)，2013，22(15):103－104．

[4]耿 煜，劉利群．亞低溫治療急性重型顱腦損傷40例[J]．中國藥業(yè)，2009，18(11):50 －51．

[5]Koichi T， Yoshikatsu S， Hiroaki K， et al．Protection from postischemic spinal cord injury by perfusion cooling of the epidural space during most or all of a descending thoracic or thoracoabdominal aneurysm repair[J]．Gen Thorac Cardiovasc Surg，2010，58:228 － 234．

[6]Papakostas JC，Matsagas MI，Toumpoulis IK，et al．Evolution of spinal cord injury in a porcine model of prolonged aortic occlusion[J]．J Surg Res，2006，133:159 － 166．

[7]Taketomo M，Kazumasa O，Bagus H，et al．Sodium 4 － phenylbutyrate protects against spinal cord ischemia by inhibition of endoplasmic reticulum stress[J]．J Vasc Surg，2010，52:1 580 － 1 586．

[8]T．Brett R，Curtis GT，David OO，et al．Early adenosine receptor activation ameliorates spinal cord reperfusion injury[J]．J Cardiovasc Med(Hagerstown)，2008，9(4):363 － 367．

[9]Florian B，Vintilescu R，Balseanu AT，et al．Long－ term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia．Neurosci[J]．Lett，2008，438：180 － 185．

[10]Coimbra C，Drake M，Boris－ Moller F，et al．Long－ lasting neuroprotective effect of postischemic hypothermia and treatment with an anti－inflammatory／antipyretic drug:evidence for chronic encephalopathic processes following ischemia[J]．Stroke，1996，27：1 578 － 1 585．

[11]Nito C，Kamiya T，Ueda M，et al．Mild hypothermia enhances the neuroprotective effects of FK506 and expands its therapeutic window following transient focal ischemia in rats[J]．Brain Res，2004，1 008：179 － 185．

[12]Ross SD，Kern JA，Gangemi JJ，et al．Hypothermic retrograde venous perfusion with adenosine cools the spinal cord and reduces the risk of paraplegia after thoracic aortic clamping[J]．J Thorac Cardiovasc Surg，2000，119(3):588－595．