蒙藥玉簪花總多糖提取工藝優選與含量測定

王娜娜，薛培鳳，耿 婕，魏 慧，李鳳英，張冬艷

（內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110）

蒙藥玉簪花是百合科植物玉簪 Hosta plantaginea（Lam．）Aschers．的干燥花，又名內消花、白鶴花、白玉簪等，是蒙醫專用、常用藥材之一，具有悠久的蒙醫臨床用藥歷史和確切的療效。蒙藥典籍《蒙藥正典》中已有記載?！吨腥A本草》（蒙藥卷）記載其性寒，味澀、苦，效軟、柔、稀，具有清熱、解毒、止咳、利咽喉之功效，主治咽喉腫痛、音啞、肺熱、毒熱。但有關玉簪花及其制品中多糖的檢測方法及含量的影響因素，國內外尚無文獻報道。本試驗采用單因素及正交試驗對玉簪花總多糖提取工藝進行了優選，并建立了測定玉簪花多糖含量的方法，為玉簪花的進一步開發利用及其多糖的生物活性研究奠定基礎[1]。

1 儀器與試藥

AL204型電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；BFX5－320型低速自動平衡離心機（白洋離心機廠）；IKARV10型旋轉蒸發儀（德國）；HH－S型數顯恒溫油浴鍋（金壇市醫療儀器廠）；BGZ－146型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）。玉簪花藥材于2013年2月購自內蒙古藥材公司，經內蒙古醫科大學喬俊纏教授鑒定為百合科植物玉簪H．plantaginea的花；葡萄糖(天津市福晨化學試劑廠)，無水乙醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)，苯酚（天津永晟精細化工有限公司），石油醚(天津市風船化學試劑科技有限公司)，濃硫酸（天津大茂化學試劑廠），以上試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 提取工藝單因素考察[2]

2．1．1 提取溫度

將玉簪花藥材粉碎過40目篩，稱取1．0 g干燥的玉簪花藥材粉末5份，精密稱定，分別以石油醚30 mL回流脫脂3 h，揮去石油醚。脫脂后的藥材分別在室溫條件下以水浸泡2 h，料液比1 ∶20，在不同溫度（60，70，80，90，100 ℃）下提取 2 h，提取次數為1次，過濾去渣，向提取液中加無水乙醇至含醇體積為80%，沉淀多糖，放入冰箱，靜置過夜，離心。將沉淀的多糖溶于蒸餾水，采用苯酚硫酸法測定其含量。在上述條件下，每份平行操作2次，結果取2次測定的平均值，考察提取溫度對總多糖得率的影響[3]。結果見表1。

2．1．2 提取時間

方法同 2．1．1 項，提取溫度為 90 ℃ ，在不同提取時間（1，2，3，4，5 h）內各提取1次，測定其含量，考察提取時間對總多糖得率的影響[4]。結果見表1。

2．1．3 料液比

方法同 2．1．1項，提取時間為 3 h，提取溫度為 90℃，在不同料液比（1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50）條件下各提取 1 次，測定其含量，考察料液比對總多糖得率的影響。結果見表1。

2．1．4 提取次數[5]

方法同 2．1．1項，按料液比 1∶20，提取溫度為 90℃，提取時間為3 h，在不同提取次數的條件下，測定其含量，考察提取次數對總多糖得率的影響。結果見表1。

2．2 提取工藝正交試驗[6－7]

在2．1項下單因素試驗基礎上，結合文獻，以料液比（因素A）、提取時間（因素 B）、提取溫度（因素 C）、提取次數（因素 D）為最終因素進行考察，每個因素3水平，進行 L9(34)4因素3水平正交試驗，以玉簪花總多糖得率為考察指標。因素水平表見表2(正交試驗重復做2次，結果取2次測定的平均值)。正交試驗結果及方差分析結果見表3和表4。可見，因素D對提取工藝有顯著性影響（P＜0．05），各因素的影響大小順序依次為 D＞A＞B＞C，即提取次數＞料液比＞提取時間＞提取溫度。結合單因素試驗及正交試驗結果，得出各因素的最佳水平依次為A3B3C3D2。根據生產實際考慮，B選擇 B2。綜合選擇，最佳提取工藝條件為A3B2C1D2，即料液比 1∶30，提取時間 3 h，提取溫度 80℃，提取次數3次。

表1 玉簪花多糖提取工藝單因素考察結果

表2 提取工藝正交試驗因素水平表

表3 正交試驗結果

表4 正交試驗方差分析結果

2．3 含量測定及方法學考察[8]

2．3．1 對照品溶液制備

稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10．01 mg，精密稱定，加水溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即得葡萄糖對照品貯備液(0．1 g ／L)[9]。

2．3．2 測定波長選擇[10]

采用苯酚－硫酸顯色法，分別精密吸取對照品及供試品溶液1 mL，加入5%苯酚溶液 1 mL，充分搖勻，迅速貼壁加入濃硫酸5 mL，靜置 30 min。同法制得空白對照溶液，在紫外分光光度計200～600 nm波長范圍掃描，作圖。確定本試驗玉簪花藥材中總多糖的測定波長為488 nm。

2．3．3 方法學考察

線性關系考察：精密量取葡萄糖對照品貯備液 0．2，0．3，0．4，0．6，0．7，0．8 mL，置 6 個干燥試管中，分別加水補至 1．0 mL，在488 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、含量為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝8．903 6 X＋0．041 7，r＝0．999 4（n＝6）。結果表明，葡萄糖溶液質量濃度在 0．02～0．08 g／L 范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

精密度試驗：取同一對照品溶液，分別依法測定6次。結果吸光度的 RSD＝0．17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一樣品6份，依法制備供試品溶液并測定含量。結果的 RSD＝2．96%（n＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，于制備后6 d內每隔1 h測定 1次吸光值，共測定 6次。結果的 RSD＝1．21%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：稱取6份玉簪花藥材粉末各 0．5 g，精密稱定，脫脂提取、沉淀多糖后，定容于50 mL容量瓶中，吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加入已知質量濃度的葡萄糖對照品溶液，用蒸餾水定容。按標準曲線項下苯酚－硫酸法分別測定吸光度，根據葡萄糖的檢出量計算回收率。結果葡萄糖平均回收率為98．26% ，RSD ＝2．05% （n＝6）。

2．3．4 樣品含量測定

準確稱量玉簪花粉末1．0 g，對原料脫脂后，室溫條件下浸泡2 h，根據正交試驗最佳提取條件（即料液比為1∶30，80℃提取3次，每次3 h）提取，合并提取液，減壓濃縮，向濃縮液中加無水乙醇至含醇80%，沉淀多糖，放入冰箱(4℃)，靜置過夜；離心分離，沉淀多糖全部溶于蒸餾水，定容，即得供試品溶液。采用苯酚－硫酸法，測定其含量，結果為3．65%。

表5 最佳提取工藝驗證試驗

2．4 最佳提取工藝驗證

稱取玉簪花粉末20 g，以正交試驗優選的最佳提取工藝參數進行試驗驗證，應用優化后工藝條件進行提取，按擬定含量測定方法依次測定。結果見表5。可見，多糖得率平均值比單因素試驗的得率高，且 3次得率基本接近，說明用優化后的工藝條件重復性好。

3 討論

多糖是一類天然大分子化合物，由10個以上至成千個單糖脫水形成的天然高分子聚合物，是構成生命的分子基礎之一。多糖易溶于水，不溶于乙醇等有機溶劑，最常見的提取方法是水提醇沉，沉淀干燥后即為粗多糖。大量的藥理及臨床研究表明，多糖具有抗癌、增強免疫力等作用，對于預防和治療包括癌癥在內的多種疾病都具有巨大的潛力，因此多糖的研究目前已成為關注的焦點。百合科植物多糖的研究在近年才逐漸開展起來，提取條件已比較清楚，可考慮進一步放大處理。但對其化學結構的研究仍然非常有限，大多數已報道的百合科植物多糖的結構信息不夠詳盡，高級結構的研究還是空白，故需作進一步的結構分析。有關其藥理作用方面的研究較多，但沒有涉及進一步的作用機理及功能結構。從應用研究的角度來看，百合科植物多糖具有很多藥理作用，極有潛力開發為新型的藥物和保健品。百合科植物種類很多，分布也很廣，資源極其豐富，多糖含量高，因此對百合科植物多糖進行廣泛深入地研究，具有巨大的開發和應用價值。

本試驗采取單因素試驗及4因素3水平正交試驗方案對玉簪花多糖的提取條件進行了優化。由正交試驗結果分析可知，提取次數是最主要的影響因素，其次是料液比，提取時間及提取溫度影響不顯著。工藝放大試驗研究表明，該工藝條件簡單、穩定可行，為有效開發利用玉簪花多糖奠定了基礎。

采用苯酚－硫酸法測定玉簪花多糖的含量，通過石油醚脫脂，揮干后水提，再以乙醇醇沉分離多糖成分。方法學考察結果表明，采用該法測定玉簪花多糖的含量，方法簡單、可靠、重復性好、顯色穩定。

綜上所述，玉簪花多糖尚待進一步研究，通過基礎的最佳提取方法確定和含量測定，為進一步研究多糖的純化方法及藥理活性奠定了基礎。訊作者，(電話)0471 －6653146（電子信箱）xpfdc＠ vip．sina．com。

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