虎杖飲片、水煎劑、配方顆粒高效液相色譜特征圖譜相關性研究

(培力＜南寧＞藥業有限公司，廣西 南寧 530007)

虎杖為蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根及根莖，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效[1]，主要含有白藜蘆醇、虎杖苷、大黃素、大黃素甲醚和虎杖素A等成分[2-4]。虎杖配方顆粒是以符合炮制規范的虎杖飲片為原料，經現代化提取、濃縮、干燥、制粒等工藝技術加工而成，僅供中醫師臨床處方時使用的顆粒制劑，具有體積小、服用與攜帶方便、起效迅速、療效確切的優點，且保留了傳統中藥湯劑的“原汁原味”。但中藥飲片經過一系列制劑工藝加工處理制成配方顆粒后，失去了原飲片的許多外觀、顯微及理化特征，無法再用常規的技術手段(如顯微觀察、理化反應)進行有效地鑒別。若僅按照《中國藥典》對其指標成分進行含量測定，則較難全面地判定配方顆粒的真偽與優劣，從而給企業或國家藥品主管部門的質量控制、監管造成一定的困難。因此，制訂具有專屬性強、重復性好、有效可行的技術方法來控制中藥配方顆粒質量，顯得尤為重要[5]。特征圖譜的研究比指紋圖譜較簡單，但能很好地給中藥產品的定性鑒別提供準確的依據，其在中藥配方顆粒質量標準研究方面的應用得到了國家藥典委員會的認可和推崇。采用高效液相色譜(HPLC)法對虎杖飲片、水煎劑和配方顆粒的特征圖譜進行相關性研究，目前尚未見報道。本研究中，采用HPLC法分別建立虎杖飲片、水煎劑和配方顆粒的特征圖譜，并比較三者主要化學成分的差異，旨在為中藥配方顆粒替代傳統飲片的可行性研究以及臨床應用研究提供科學依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

美國Agilent 1100型高效液相色譜儀，主要包括QuatPump四元泵、VWD紫外檢測器、ChemStation工作站；MILLI-Q型超純水儀(美國)；GR-202型電子分析天平(日本)；CREST超聲波處理器(美國)?；⒄葘φ账幉?批號為120980-201005)，大黃素對照品(批號為 110756-200110)，大黃素甲醚對照品(批號為110758-200610)，均購自中國食品藥品檢定研究院；虎杖苷對照品(批號為MUST-11052301)，白藜蘆醇對照品(批號為MUST-11050301)，購自成都曼思特生物科技有限公司；10批不同來源虎杖飲片(產地廣西，編號為1-10)，均經廣西區食品藥品檢驗所韋家福老師鑒定為蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根及根莖；10批虎杖水煎劑(編號為L-U)，嚴格按照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》藥材煎煮方法相關要求制備；11批大生產虎杖配方顆粒(編號為A-K，批號A為A070299，B為A070553，C為A080064，D為A080756，E 為A081228，F為A081716，G 為 A082114，H 為 A090569，I為 A091028，J 為 A100749，K 為A101617，由培力(南寧)藥業有限公司提供)；乙腈為色譜純(Meck公司)，其他試劑均為分析純。相似度評估軟件為國家藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取11批虎杖配方顆粒，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，取出，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得虎杖配方顆粒供試品溶液；取10批虎杖藥材粉末(過3號篩)，各取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照制備方法制備得虎杖藥材供試品溶液；稱取10批虎杖飲片各100 g，加水(水面高出藥材約5 cm)，浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，倒出煎液，藥渣再分別加水煎煮2次，時間依次為30 min和20 min，合并3次煎液，水浴上濃縮、過濾，濃縮至浸膏，真空干燥，得干浸膏，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，照虎杖配方顆粒供試品溶液的制備方法制備得虎杖水煎劑供試品溶液。取虎杖苷對照品、白藜蘆醇對照品和大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含虎杖苷40 μg、白藜蘆醇20 μg和大黃素80 μg的混合溶液，即得對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱:Lichrospher RP-18e柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Merck公司)；流動相:以乙腈(A)和0.1%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫(見表 1)；檢測波長:306 nm；進樣量:10 μL；流速:1.0 mL/min[5]。

表1 梯度洗脫程序

2.3 方法學考察

選擇峰2作為參照峰，計算樣品中7個主要特征峰的相對保留時間(RRT)、相對峰面積(RPA)的 RSD值。以批號為A101617的虎杖配方顆粒進行方法學考察。

精密度試驗:按照2.1項下方法制備虎杖配方顆粒供試品溶液，連續進樣6次，考察儀器的精密度。結果各主要特征峰RRT的 RSD為0.25% ～0.28%，RPA的 RSD為0.12% ～0.91%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:按照2.1項下方法制備虎杖配方顆粒供試品溶液，分別于制備后0，4，8，12，16，24h時檢測，考察供試品溶液的穩定性。結果各主要特征峰RRT的 RSD為0.30%～0.44%，RPA的 RSD為0.07%～1.29%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗:按照2.1項下方法制備6份虎杖配方顆粒樣品溶液，依法測定，考察方法的重復性。結果各主要特征峰RRT的RSD為0.34% ～0.47%，RPA的 RSD為0.22% ～0.95%，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的虎杖供試品6份，分別精密加入一定量的大黃素對照品或虎杖苷對照品，混勻后依法測定其峰面積，計算回收率。結果見表2。

2.4 虎杖配方顆粒特征圖譜的建立

虎杖藥材、水煎劑與配方顆粒相關性研究:分別精密吸取各供試品溶液、對照品溶液各10 μL，照擬訂的色譜條件測定，記錄80 min的色譜圖。參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》建立HPLC特征圖譜，色譜圖見圖1至圖4。由圖4可見，虎杖配方顆粒(C)與虎杖水煎劑(B)成分基本一致，而藥材制成水煎劑及顆粒后，4號峰含量增加，8號峰、10號峰消失，但7個主要成分[1號、2號(虎杖苷)、3號(6號白藜蘆醇)、7 號、9 號、11號(大黃素)]在虎杖飲片、虎杖水煎劑、虎杖配方顆粒中均存在。可見，虎杖飲片制成配方顆粒后，有效成分虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇尚存，故含量測定指標性成分的選擇仍可參照藥典。

表2 含量測定加樣回收試驗結果(n=6)

圖1 10批虎杖藥材HPLC特征圖譜

圖2 10批虎杖水煎劑HPLC特征圖譜

圖3 11批虎杖配方顆粒HPLC特征圖譜

圖4 虎杖飲片、水煎劑、配方顆粒HPLC特征圖譜比較

參照峰的選擇與共有特征峰的標定:設定各色譜圖的積分參數為:斜率靈敏度為5，峰寬為0.05，最小峰峰面積占總峰面積的比例大于1%，積分起止時間10～80 min。通過比對虎杖藥材、虎杖水煎劑、虎杖配方顆粒的特征圖譜，選定三者均有的7個特征峰作為共有峰。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》自動匹配虎杖配方顆粒HPLC圖譜的相關參數，標定其中匹配數目為7的色譜峰為共有特征峰，共有特征峰面積均大于色譜峰總面積的90%。通過與對照品色譜圖比較可知，在特征圖譜的7個共有峰中，峰2為虎杖苷，峰4為白藜蘆醇，峰7為大黃素。結果見圖5及表3。

相似度評價:采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》計算相似度，即以生成的對照譜圖為參照，各樣品特征圖譜與對照譜圖進行比較，計算得各批次虎杖配方顆粒圖譜的相似度及各特征峰的RRT及RPA。結果見表4和表5?？梢?，10批虎杖藥材特征圖譜的相似度均在0.98以上，說明10批不同來源的虎杖藥材成分有良好的相似性；11批虎杖配方顆粒特征圖譜的相似度均在0.99以上，說明虎杖配方顆粒的化學成分一致性較好，該公司產品制劑工藝較穩定。所標定的虎杖配方顆粒7個共有特征峰，經多批次產品驗證，各峰均可在藥材及水煎劑特征圖譜中得到追蹤，表明了虎杖配方顆粒與虎杖藥材、虎杖水煎劑在化學成分上的一致性，為中藥配方顆粒替代傳統飲片的可行性研究以及臨床應用研究提供了科學依據。另外，各峰重復性好、RRT穩定，可作為該產品特征圖譜的共有峰，用于生產過程各環節的質量控制。

3 討論

考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-0.1%磷酸3種流動相梯度洗脫的效果，結果以乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫，峰形及分離度均較好。分別考察了同一供試品溶液于 230，254，284，306，437 nm 檢測波長下的色譜圖，結果 230 nm時的色譜圖基線漂移較嚴重，437 nm時的色譜圖色譜峰數量較少；254，284，306 nm檢測波長下的色譜圖相互比較，結果以306 nm作為檢測波長的色譜圖色譜峰數量較多，響應值較高，峰形和分離度較好。最終選擇以乙腈-0.1%磷酸作為流動相梯度洗脫，以306 nm作為檢測波長。

分別用甲醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙醇對虎杖配方顆粒進行超聲提取，結果50%乙醇提取效率較高，色譜峰數量較多，色譜峰的強度較大，且50%乙醇對虎杖中的虎杖苷和白藜蘆醇的提取效率也較高。

圖5 混合對照品溶液和虎杖配方顆粒供試品溶液鏡像色譜圖

表3 對照特征圖譜的特征數據

表4 虎杖飲片、虎杖水煎劑、虎杖配方顆粒特征圖譜的相似度數據

在HPLC特征圖譜中，11批配方顆粒圖譜的相似度均在0.99以上，說明產品成分一致性較好，其原藥材質量穩定、生產工藝穩定可靠。文中所建立的HPLC特征圖譜分析方法簡便、穩定、重現性好，能較全面地反映虎杖配方顆粒的內在質量，為其質量控制提供了科學依據。

表5 11批虎杖配方顆粒的RRT及RPA

目前，應用于中藥配方顆粒鑒別的技術方法報道較少，僅有薄層色譜(TLC)、傅里葉-紅外光譜(FT-IR)及HPLC指紋圖譜等幾種。前兩者具有操作簡單、快速等優點，但專屬性不強，較難全面反映從原藥材加工到中藥配方顆粒整個生產過程中化學成分方面的細微差異。而HPLC特征圖譜技術方法較成熟，彌補了前兩者的不足，可從化學成分角度去體現中藥材(或飲片)、中藥湯劑與中藥配方顆粒的相似(或差異)性[6]，操作也不復雜。更重要的是，它給多年來一直困擾大家的“中藥飲片與中藥配方顆粒是否等質”等爭議性問題提供了有力的證據，也逐漸得到了國家藥監部門的認可和推崇。

綜上所述，本研究中所建立的虎杖配方顆粒HPLC特征圖譜分析方法簡便穩定、重復性好，能較全面地反映虎杖配方顆粒的內在質量，為其質量控制提供了科學依據。

參考文獻：

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