不同產(chǎn)地與規(guī)格半夏中4種核苷(或堿基)的含量測定及統(tǒng)計分析

阮洪根，何祿仁，宋平順，趙建邦，丁永輝

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 甘肅省食品藥品檢驗所·甘肅省中藥品質(zhì)與安全工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730000； 甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅 蘭州 730000)

半夏為天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb)Breit的干燥塊莖[1]，具有鎮(zhèn)咳、抗心律失常、抗腫瘤、解毒抗炎的作用，臨床藥理作用廣泛[2]。吳皓等[3]從半夏水溶性成分中分離到肌苷認(rèn)為是其指標(biāo)成分，也是半夏藥材的鑒別成分。也有學(xué)者在半夏的水提液中檢測到尿苷[4]。除肌苷、尿苷外，從半夏中還檢測到尿嘧啶、黃嘌呤。核苷類成分參與DNA代謝過程，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性[5]。20世紀(jì)90年代，國內(nèi)開始有對半夏藥材中核苷類成分的報道，多采用高效液相色譜(HPLC)法[6]。本研究中，對半夏藥材中尿嘧啶(堿基)、黃嘌呤(堿基衍生物)、尿苷和肌苷(次黃嘌呤核苷)進(jìn)行了含量測定，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行充分分析、比較，旨在對半夏的質(zhì)量控制指標(biāo)作進(jìn)一步認(rèn)識。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括2695-2998PDA型檢測器；萬分之一電子分析天平，Mettle-AE163型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler公司)；H1650型離心機(jī)(長沙湘儀)；超聲波清洗器(昆山儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，定量分析濾紙。尿嘧啶(批號為100469-200401)、黃嘌呤(批號為 140662-200301)、尿苷(批號為 887-200202)、肌苷(批號為140669-201104)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，純度均大于99.5%；蒸餾水。半夏藥材的采集地為甘肅天水、武都、西和、徽縣以及云南、貴州、江西、湖北等地，藥材經(jīng)甘肅省食品藥品檢驗所宋平順主任藥師鑒定為天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb)Breit的干燥塊莖。半夏藥材均干燥、粉碎、過4號篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱取尿嘧啶4.48 mg、黃嘌呤8.94 mg、尿苷6.65 mg、肌苷4.07 mg，分別定容于50 mL容量瓶中，得對照品貯備液；分別依次吸取上述對照品貯備液2，3，3，2 mL混合于10 mL容量瓶中，得混合對照品貯備液。稱取半夏藥材1.5 g，精密稱定，置磨口具塞錐形瓶中，分別加水20 mL和15 mL，超聲提取2次，每次30 min，于3 000 r/min離心10 min，抽濾，合并濾液，濾液濃縮，定容至10 mL，于3 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件[7]及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Kromasil100-5C18E51072色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相:水；流速0.8mL/min；柱溫:30℃；測定波長:254 nm；進(jìn)樣量:10μL。在此條件下，色譜圖見圖1。尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷的保留時間依次是4.8，8.6，10.6，26.0min，理論塔板數(shù)以尿嘧啶計不低于8000，分離度優(yōu)良。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取混合對照品貯備液5 mL和2 mL分別置10 mL容量瓶中，1 mL置25 mL容量瓶中，1 mL置100 mL容量瓶中；加水稀釋至刻度，搖勻，連同原貯備液制得標(biāo)準(zhǔn)曲線對照品溶液系列。分別進(jìn)樣4次，以對照品溶液的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、峰面積平均值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得4個組分的回歸方程。結(jié)果見表1。

精密度試驗:稱取半夏藥材(甘肅徽縣)1.5 g，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣6次。結(jié)果尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷峰面積的 RSD依次為0.89%，1.21%，1.32%，1.53%(n=6)。

重復(fù)性試驗:稱取半夏藥材(甘肅徽縣)1.5 g，精密稱定，共6份，按2.1項下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定含量。結(jié)果尿嘧啶、黃嘌呤、尿苷、肌苷含量的 RSD依次為2.36%，2.23%，1.95%，2.44%(n=6)。

圖1 高效液相色譜圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

加樣回收試驗:稱取半夏藥材(甘肅徽縣)0.75 g，精密稱定，用移液器精密加入0.15 mL尿苷、0.05 mL黃嘌呤、0.50 mL尿苷、0.20 mL肌苷對照品貯備液，分別加水19.1 mL和15 mL，按2.1項下供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法進(jìn)樣測定核苷(或堿基)含量，計算回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測定與分析

甘肅不同產(chǎn)地及甘肅省外半夏藥材:稱取甘肅不同產(chǎn)地及甘肅省外半夏藥材樣品1.5 g，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定核苷(或堿基)含量，結(jié)果見表3。樣品聚類分析結(jié)果見圖2。

不同規(guī)格半夏藥材:稱取3個產(chǎn)地的不同規(guī)格(大粒、中粒、小粒)的半夏藥材，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定含量。結(jié)果見表4。

樣品嵌套設(shè)計資料方差分析:結(jié)果見表5和表6。

3 討論

制備供試品溶液時，樣品提取過程中，采用超聲后離心、上清液再抽濾的方法，提取效果好。若直接抽濾，濾液下滴速度慢、難度大，基本上無法操作。

聚類分析結(jié)果顯示，編號為1，2，3，4，5，6，8 號的樣品聚為一類，7，9，10，11，12，13 號的樣品聚為另一類。1，2，3，4，5，6，8 號樣品均為甘肅省內(nèi)樣品，10，11，12，13號樣品為省外樣品。7號為引種品種，與省外聚合為一類，可見引種與省外樣品的來源一致。9號樣品不知來源，但從其與省外樣品合并為一類，可初步判定其也為引種品。因此，甘肅省與省外的半夏品種可很好地區(qū)分，顯示出其道地性。

嵌套設(shè)計資料的方差結(jié)果顯示，模型檢驗Corrected Model的F=14.727，P=0.000，所統(tǒng)計的數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義；因素規(guī)格的統(tǒng)計量 F=0.292，P=0.749＞0.01，說明不同規(guī)格樣品間核苷(堿基)含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明半夏大粒、中粒、小粒間質(zhì)量無明顯差異，故規(guī)格不能作為評判半夏質(zhì)量的指標(biāo)。因素產(chǎn)地的統(tǒng)計量 F=39.348，P=0.000＜0.01，說明不同產(chǎn)地樣品間核苷(堿基)含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可進(jìn)一步作多重比較。由LSD法多重比較結(jié)果可知，產(chǎn)地1(甘肅永靖)樣品的核苷含量最高，優(yōu)于產(chǎn)地2(貴州)樣品和產(chǎn)地3(云南)樣品；產(chǎn)地2和產(chǎn)地3比較，P=0.686＞0.01，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

表3 甘肅不同產(chǎn)地及甘肅省外半夏中核苷(或堿基)含量測定結(jié)果(n=4)

圖2 樣品聚類分析圖

表4 不同規(guī)格半夏藥材中核苷(或堿基)含量測定結(jié)果(n=4)

表5 主體間效應(yīng)的檢驗表

表6 LSD法多重比較表

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:110-113.

[2]徐 萍，張學(xué)蘭，吳暢灝.半夏的研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2003，12(3):76.

[3]吳 皓，李 偉，張科衛(wèi)，等.半夏藥材鑒別成分的研究[J].中國中藥雜志，2003，28(9):836.

[4]Chen P，Li C，Liang S，et al.Characterization and quantification of eight water-soluble constituents in tuber of Pinellia ternata and in tea granules from the Chinese multiherb remedy Xiaochaihutang[J].J Chromatogr B，2006，843(2):183-193.

[5]Kinahan JJ，Kowal EP，Grindey GB.Biochemical and antitumor effects of the combination of thymidine and 1-β-D-arabinofuranosylcy tosine against eukemia L1210[J].Cancer Res，1981，41(2):445.

[6]葛秀允，吳 皓.半夏的化學(xué)成分及質(zhì)量評價方法[J].中國藥業(yè)，2009，18(9):4.

[7]呂愛娟，張志澄，張科衛(wèi)，等.RP-HPLC法同時測定半夏中5種核苷含量的研究[J].藥物分析雜志，2007，27(7):1 051.