阿歸養血顆粒質量標準研究

趙 勇，王 艷，龍海燕，丁 野，李文莉

(1.湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001； 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208)

阿歸養血顆粒收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第十二冊)》[1]，由當歸、黨參、白芍、甘草、茯苓、黃芪、熟地黃、川芎、阿膠九味藥組方，具有補養氣血的作用，用于氣血虧虛、面色萎黃、眩暈乏力、肌肉消瘦、經閉、赤白帶下等癥候。原標準中僅收載了專屬性不強的化學鑒別和當歸的薄層色譜(TLC)鑒別。為進一步控制藥品內在質量，保證臨床用藥安全、有效，筆者對其質量標準進行了深化研究，修訂了當歸的鑒別，增加了方中白芍、黃芪、甘草的TLC鑒別，并建立了采用高效液色譜(HPLC)法測定白芍中芍藥苷含量的方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

LC-2010A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；CG-300型超聲波清洗器(300 W，25 kHz，江蘇張家港港威超聲波儀器廠)，AE-240型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。阿魏酸對照品(批號為110773-200611)、芍藥苷對照品(批號為110736-200629)、甘草對照藥材(批號為 120904-200511)、甘草苷對照品(批號為111610-200604)、黃芪甲苷對照品(批號為110781-200613)，均購自中國藥品生物制品檢定所；阿歸養血顆粒由國內4家生產企業提供，共8批樣品，批號分別為061102，061103， 061104， 060901， 06125001， 20060306， 20060307，20060308；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC法鑒別[2]

2.1.1色譜條件

色譜柱:Hypersil BDS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(13∶87)；檢測波長:323 nm；流速:1.0 mL/min；柱溫:40℃。

2.1.2溶液制備

取含量測定項下的供試品溶液，作為供試品溶液；取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得對照品溶液；按處方稱取缺當歸和川芎的其他藥材，按制備工藝制成缺當歸和川芎的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成雙陰性對照品溶液。

2.1.3測定法

分別精密吸取對照品溶液5 μL、供試品溶液和雙陰性對照品溶液各15 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，出現與對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰，缺當歸和川芎的雙陰性對照品溶液無干擾(見圖1)。

2.2 TLC鑒別

白芍[3]:取本品50 g，研細，加甲醇70 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用以水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30 mL，棄去堿液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。再按處方比例稱取除白芍外其他藥材適量，制成缺白芍的陰性樣品，同法制成缺白芍的陰性對照品溶液。照TLC法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(45∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，缺白芍的陰性對照無干擾。見圖2A。

圖1 當歸和川芎高效液相色譜鑒別圖

甘草[4]:取本品25 g，研細，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用以水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用以正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.5 g，加甲醇25 mL，超聲處理20 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方比例稱取除甘草外其他藥材適量，制成缺甘草的陰性樣品，同法制成缺甘草的陰性對照品溶液。照TLC法[2005年版《中國藥典(一部)》附錄VI B]試驗，吸取上述4種溶液各5～10 μL，分別點于同一含1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，缺甘草的陰性對照無干擾。見圖2B。

圖2 薄層色譜圖

黃芪[5]:取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方比例稱取除黃芪外其他藥材適量，制成缺黃芪的陰性樣品，同甘草鑒別項下供試品溶液制備方法制成缺黃芪的陰性對照品溶液。照TLC法[2005年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取對照品溶液、甘草鑒別項下供試品溶液及缺甘草的陰性對照品溶液各15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，缺黃芪的陰性對照無干擾。見圖2C。

2.3 芍藥苷含量測定[6-9]

2.3.1色譜條件

色譜柱:Agilent TC-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈-水(10∶90)；柱溫:35 ℃；流速:1.0 mL/min；檢測波長:230 nm。

2.3.2溶液制備

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，即得對照品溶液。取裝量差異項下的本品適量，研細，取約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質量，密塞，超聲處理15 min(功率300 W，頻率25 kHz)，放冷，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3方法學考察

系統適用性試驗:分別吸取2.3.2項下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3。供試品溶液色譜中芍藥苷能達到基線分離，分離度符合要求，理論板數按芍藥苷峰計算應不低于5 000，陰性對照無干擾。

線性關系考察:精密吸取芍藥苷對照品溶液(48.56 μg/mL)1，2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，以峰面積積分值為縱坐標(Y)、進樣量(X，μg)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y=1 194 685.842X+9 458.073 505，r=0.999 9(n=6)。結果表明，芍藥苷對照品進樣量在0.048 56～0.971 2 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次。結果芍藥苷峰面積的 RSD為0.5%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批(批號為110736-200629)樣品，按擬訂方法制備6份供試品溶液，依法測定。結果平均含量為0.208 7 mg/g，RSD為1.1%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于配制后的0，3，6，9，12，15 h時依法測定。結果芍藥苷峰面積的 RSD為1.0%(n=6)，表明供試品溶液在15 h內穩定。

圖3 芍藥苷含量測定高效液相色譜圖

加樣回收試驗:取已測定含量的同一批(批號為20060306)樣品(含芍藥苷0.208 7 mg/g)約2.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入對照品溶液(0.485 6 mg/mL)1 mL，置水浴上蒸干，放冷，精密加入甲醇25 mL，依法制備供試品溶液，測定并計算。結果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.3.4樣品含量測定

按擬訂方法測定8批樣品的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

原標準中收載了當歸的TLC鑒別，經試驗驗證發現，缺當歸的陰性對照有干擾，經分析干擾主要來自方中的川芎，兩者在現有TLC條件下很難區分，故采用HPLC法鑒別兩者中的阿魏酸并作為質量控制指標。

白芍的TLC鑒別曾考察了將展開劑中毒性較大的三氯甲烷改為毒性較小的二氯甲烷，結果所得供試品TLC圖效果較差，斑點較模糊。

甘草的TLC鑒別時比較了乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)、三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1)2種展開劑。結果以前者分離效果較好，斑點清晰，能得到甘草中主要的4個黃色主斑點，陰性對照無干擾。

黃芪的TLC鑒別時，曾考察了供試品溶液的制備方法，先用甲醇回流提取，后用水飽和的正丁醇振搖提取，最后過中性氧化鋁柱，結果所得TLC圖斑點較模糊，分析原因可能為黃芪甲苷在過中性氧化鋁柱時有部分損失。另外，也考察了將展開劑中毒性較大的三氯甲烷改為毒性較小的二氯甲烷，結果所得供試品TLC圖效果較差，Rf值較高。

含量測定項曾考慮以阿魏酸作為測定指標，但根據各藥味的處方用量及2010年版《中國藥典(一部)》[10]各藥材項下含量測定規定限度，按理論值推算的阿魏酸含量低于芍藥苷，且該成分穩定性不如芍藥苷，故選擇白芍中芍藥苷為定量指標成分。

芍藥苷的含量測定時，比較了甲醇、80%的甲醇、50%的甲醇3種提取溶劑，以及加熱回流和超聲處理2種提取方法，結果所測得芍藥苷的含量基本一致，但以甲醇超聲處理方法操作簡單，所得供試品溶液黏度小、顏色淺、易于濾過，故選擇該方法作為供試品溶液的制備方法。流動相比較了甲醇-0.05%冰醋酸(25∶75)、乙腈-0.1% 磷酸溶液(13∶87)、乙腈-水(13∶87)3 種流動相，結果以流動相乙腈-水(13∶87)所得色譜峰對稱性較好，且對色譜柱的損傷較小，故選擇乙腈-水(13∶87)為流動相。

4個生產廠家提供的樣品中芍藥苷的含量相差極大，分析原因可能為原法定標準中無芍藥苷的定量項目，某些企業存在偷工減料、少投或以次充好等違法現象。為了更好地控制產品的質量，保證臨床用藥安全有效，有必要建立芍藥苷的含量測定項。

參考文獻：

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