高效液相色譜法測(cè)定藏成藥二十五味兒茶丸中烏頭堿的含量

達(dá)娃卓瑪，武尉杰，魏 屹，譚 睿

(1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，西藏 拉薩 850000； 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

二十五味兒茶丸是藏醫(yī)傳統(tǒng)藥方，用于治療“白脈”病、痛風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫痛變形與四肢僵硬、黃水病、“岡巴”病等。本品由兒茶、西藏棱子芹、黃精、天冬、喜馬拉雅紫茉莉、蒺藜、乳香、決明子、黃癸子、寬筋藤、麝香、鐵棒錘等25味中藏藥組方，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥(第1冊(cè))》，未涉及方中成分的定性和定量測(cè)定方法。鐵棒錘中二萜類(lèi)生物堿既是有效成分，也是毒性成分。為了更好地控制二十五味兒茶丸的質(zhì)量，以高效液相色譜(HPLC)法對(duì)方中鐵棒錘所含烏頭堿進(jìn)行含量測(cè)定。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-6AD型高效液相色譜儀；Class VP色譜工作站。烏頭堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110720-201111)；二十五味兒茶丸(西藏自治區(qū)藏藥廠，批號(hào)分別為12023A，11240A；西藏神猴藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20120402；青海省藏醫(yī)院制劑；青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20090902，20101018，20110926，20110718；四川省甘孜藏族自治州藏醫(yī)院，批號(hào)為201103001)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1-4]

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:0.04 mol/L三乙胺(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(60∶40)；檢測(cè)波長(zhǎng):233 nm；柱溫:40℃。理論板數(shù)按烏頭堿計(jì)應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液制備

取烏頭堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加0.05%鹽酸甲醇制成每1 mL含14.96 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品適量，研細(xì)，取5 g，置錐形瓶中，加氨試液4 mL及乙醚50 mL，搖勻，超聲處理(功率120 W，頻率40 kHz)30 min，濾過(guò)，殘?jiān)ㄔ偬崛?次，濾過(guò)，合并濾液，低溫?fù)]干，殘?jiān)?.05%鹽酸甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加0.05%鹽酸甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察[5-6]

專(zhuān)屬性試驗(yàn):按照處方比例，取除去鐵棒錘的方中其他藥材，制備陰性樣品。取適量陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。取陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果二十五味兒茶丸中其他成分對(duì)烏頭堿的測(cè)定無(wú)干擾，專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:稱(chēng)取烏頭堿對(duì)照品7.48mg，精密稱(chēng)定，置50mL容量瓶中，加0.05%鹽酸甲醇溶解至刻度。精密吸取上述對(duì)照品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加0.05%鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為14.96 μg/mL的烏頭堿對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液 2，3，6，10，15 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=989 736.51X+757.10，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明，烏頭堿進(jìn)樣量在0.029 92～0.224 4 g范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取烏頭堿對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.40%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取樣品(青海省藏醫(yī)院)適量，依法制備供試品溶液，分別于制備0，2，4，8，12，24h 時(shí)進(jìn)樣 10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD為1.14%(n=6)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一樣品(青海省藏醫(yī)院)6份，依法制備供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1.24%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品約2.5 g，精密稱(chēng)定，加入一定量的烏頭堿對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定烏頭堿含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 烏頭堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取二十五味兒茶丸樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

取烏頭堿對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)吸光度。結(jié)果與頭堿在232.7 nm處有最大吸收，故選擇233 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

在提取二十五味兒茶丸中烏頭堿時(shí)，曾采用酸提乙醚萃取法、氨水乙醚超聲提取法，結(jié)果后者簡(jiǎn)便、快速，且提取率較高，超聲30min即可將樣品中的烏頭堿提取完全。曾比較了不同氨試液量對(duì)烏頭堿提取率的影響，結(jié)果以4 mL氨試液、超聲提取效率最高。

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