高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定復(fù)方桔梗止咳片中桔梗皂苷D含量

陳國(guó)寧，邰順章，黃柳燕

(1.江蘇省鹽城市第二人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224003； 江蘇省鹽城市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 鹽城 224002；3.鹽城師范學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

復(fù)方桔梗止咳片為鎮(zhèn)咳、祛痰的復(fù)方中藥制劑，由桔梗、遠(yuǎn)志(蜜炙)、款冬花(蜜炙)、甘草4味中藥組方，適用于咳嗽痰多，寒熱癥狀不明顯的患者。桔梗功能宣肺、利咽、祛痰、排膿、用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿，是該制劑的主要成分之一。在該制劑中，以桔梗粉碎成細(xì)粉入藥，桔梗皂苷為桔梗中主要有效成分，桔梗皂苷D是桔梗皂苷的主要皂苷成分。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有收載該藥有效成分含量測(cè)定的方法[1]。有采用薄層色譜(TLC)法對(duì)該藥主要成分進(jìn)行定性鑒別[2-4]和采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定該藥中甘草成分含量[5]的文獻(xiàn)報(bào)道，2010年版《中國(guó)藥典》[6]及有關(guān)文獻(xiàn)中有測(cè)定桔梗藥材和飲片中有效成分的含量測(cè)定方法[7-13]，也有文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)含桔梗中藥制劑的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定的方法[14-16]。為了有效控制和評(píng)價(jià)該藥的質(zhì)量，本研究中對(duì)該藥有效成分的測(cè)定方法進(jìn)行了探索，建立了測(cè)定復(fù)方桔梗止咳片中桔梗皂苷D含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)法，為該藥的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了科學(xué)的方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

美國(guó)Agilent高效液相色譜系統(tǒng)，包括G1311四元輸液泵。G1314B紫外檢測(cè)器、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A真空脫氣機(jī)、G1316A柱溫箱、Agilent 1200色譜工作站；Varian 380-LC型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)瓦里安公司)；XS205DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；YCQ-300型超聲波清洗器(上海凱波超聲設(shè)備有限公司)。桔梗皂苷D對(duì)照品(批號(hào)為111851-201204，純度為94.9%，本品極具引濕性，打開后一次性使用，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；復(fù)方桔梗止咳片(通化中辰藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為 20121206，20121208，20121212，20130309，規(guī)格為每片0.25 g；河南羚銳制藥股份有限公司，批號(hào)分別為120619，121208，規(guī)格為每片0.25g)；乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA公司，批號(hào)為1302058)，甲醇為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司)，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品52.72 mg，置20 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得桔梗皂苷D對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，用甲醇定容至10 mL，即得對(duì)照品溶液。取本品40片，精密稱定，研細(xì)，稱取約15片重，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率 40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液25 mL，置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，加硅膠0.5 g拌勻，置水浴上蒸干，加于硅膠柱[100～120目，10 g，內(nèi)徑為2 cm，用三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液濕法裝柱]上，以三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液50 mL洗脫，棄去洗脫液，再用三氯甲烷-甲醇-水(60∶20∶3)混合溶液100mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。按處方比例取除桔梗以外的其他藥材，以相同工藝制備陰性樣品，同法制備缺桔梗的陰性對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-水(25∶75)；流速:0.7 mL/min；ELSD 檢測(cè)器:漂移管溫度為90℃，載氣為1.8 Bar；進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按桔梗皂苷D峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，與相鄰組分分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取2.1項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，用甲醇分別定容至 10 mL，得系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。以桔梗皂苷D峰面積對(duì)數(shù)與質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 log(c) =0.621 3 log(a)-0.001 5，r=0.999 78(n=5)。結(jié)果表明，桔梗皂昔 D質(zhì)量濃度在125.08～1 250.8 mg/L范圍內(nèi)的對(duì)數(shù)值與峰面積對(duì)數(shù)值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定。結(jié)果桔梗皂苷D峰面積的 RSD為1.47%，峰面積對(duì)數(shù)的 RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為20121208)樣品共6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果每片含桔梗皂苷D的量分別為0.172 9，0.172 5，0.172 1，0.171 5，0.171 4，0.175 3 mg，平均0.172 4 mg，RSD為0.8%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，室溫下放置，于15 h內(nèi)每隔3 h進(jìn)樣1次，共測(cè)定6次。結(jié)果桔梗皂苷D峰面積的 RSD為1.5%(n=6)，峰面積對(duì)數(shù)的 RSD為0.17%(n=6)，表明供試品溶液在室溫放置15 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號(hào)為20121208)，置具塞錐形瓶中，共6份，精密加入對(duì)照品貯備液1 mL，按2.1項(xiàng)下供試品溶液方法制備溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 桔梗皂昔D加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取6批樣品，依法制備供試品溶液，濾過，進(jìn)樣測(cè)定，用回歸方程計(jì)算樣品中桔梗皂昔D的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

3 討論

樣品提取溶劑和提取時(shí)間的選擇:比較了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇超聲提取的效果，結(jié)果表明用50%甲醇提取效率最高。比較了不同提取時(shí)間(15，20，30，40，60 min)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果超聲30 min已基本將組分提取完全。由于樣品中有較多的組分可被提取出來，故在處理樣品時(shí)用水飽和的正丁醇進(jìn)行提取、分離，并用硅膠柱洗脫、進(jìn)一步分離。

樣品提取方法的選擇:對(duì)冷浸、超聲提取、回流提取、索氏提取4種方法進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，超聲提取的提取效率較高，同時(shí)提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便易行，故樣品制備方法采取用50%甲醇超聲提取30 min。

流動(dòng)相的選擇:分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸3種流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明，以乙腈-水(25∶75)為流動(dòng)相，桔梗皂苷D峰形對(duì)稱且分離度好，避免了樣品中其他組分的干擾。

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