正交試驗優化鎖陽中3種有效成分的提取工藝

(湖北省荊州市婦幼保健院藥劑科，湖北 荊州 434020)

鎖陽 Cynomorium songaricum Rupr.為鎖陽科鎖陽屬多年生肉質寄生草本植物，藥用部位是全草，又名“不老藥”“銹鐵棒”“沙漠人參”等，藥食兩用，主要分布于土壤缺乏有機質而富含鹽分的荒漠地帶，主產于甘肅、新疆、青海、寧夏、內蒙古等地[1]。鎖陽中，所含兒茶素具有提高免疫功能、抗氧化等活性；沒食子酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用；原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量的作用，在體外具有明顯抑制血小板聚集的活性和抗菌活性[2-3]。筆者以兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的含量為評價指標，參考文獻[4-6]，采用 L9(34)正交試驗法優選提取工藝，確定最佳提取條件，旨在為鎖陽藥材的合理開發和充分利用提供科學依據。

1 儀器與試藥

Waters 600型高效液相色譜儀，Waters 996 photodiode Array Detector二極管矩陣檢測器，Millennium 32色譜工作站(美國Waters)；Metter AE 240型十萬分之一電子天平；SK5200H型超聲波提取器(上海科導超聲儀器有限公司)；Anke TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠)。兒茶素對照品(批號為110877-200001)，沒食子酸對照品(批號為110831-200302)，原兒茶酸對照品(批號為110809-200503)，均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純(天津四友)，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純；鎖陽藥材及飲片均經蘭州大學藥學院馬志鋼教授鑒定為 Cynomorium songaricum Rupr.。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法建立

2.1.1色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，2.5 μm)；流動相:乙腈-水-36%乙酸(8∶92∶0.1)；流速:1.0 mL/min；檢測波長:258.7 nm；柱溫:室溫；進樣量:20 μL。外標法定量，在此條件下，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2對照品溶液制備

稱取兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸對照品適量，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加滅菌注射用水適量，超聲10 min，加水至刻度，配制成含兒茶素0.118 g/L、沒食子酸0.126 g/L、原兒茶酸0.147 g/L的混合對照品溶液。另取兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸對照品適量，加滅菌注射用水，分別制成含兒茶素4.945 1 g/L、沒食子酸0.208 g/L、原兒茶酸0.040 g/L的對照品貯備液。

2.1.3方法學考察

線性關系考察:精密吸取混合對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL，分別置5 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，依次取稀釋后的混合對照品溶液及未稀釋的混合對照品溶液20 μL進樣，按擬訂色譜條件測定。以對照品進樣量(X，μg)為橫坐標、峰面積積分值(Y)為縱坐標繪制標準曲線并回歸處理，得回歸方程，兒茶素 Y=82 466.81 X+281.83，r=0.999 9；沒食子酸Y=886294.46X+1485.33，r=0.9996；原兒茶酸 Y=2136116.67X+5 884.29，r=0.999 8。結果表明，對照品進樣量兒茶素在0.047～1.510 μg范圍內、沒食子酸在 0.050～1.613 μg范圍內、原兒茶酸在0.059～1.882 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

精密度試驗:分別精密吸取同一混合對照品溶液，連續進樣6次，每次20 μL。結果峰面積的 RSD兒茶素為0.93%(n=6)，沒食子酸為0.86%(n=6)，原兒茶酸為1.12%(n=6)。

重復性試驗:按樣品含量測定方法，取同一批樣品(東風場區飲片)6份，按最佳工藝提取，按樣品含量測定項下方法測定。結果兒茶素的含量為10.25 mg/g，RSD為0.79%(n=6)；沒食子酸的含量為0.403 mg/g，RSD為0.60%(n=6)；原兒茶酸的含量為0.078 mg/g，RSD為1.12%(n=6)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，避光放置，分別在制備后0，2，4，6，8，10 h 時依法進樣測定。結果峰面積的 RSD 兒茶素為1.01%(n=6)，沒食子酸為0.77%(n=6)，原兒茶酸為0.69%(n=6)，表明供試品溶液在避光條件下10 h內穩定。

加樣回收試驗:取已知含量(兒茶素10.25 mg/g，沒食子酸0.403 mg/g，原兒茶酸0.078 mg/g)的樣品(東風場區飲片)1.0 g，精密稱定，共取6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸對照品儲備液各2.0 mL，另精密加入注射用水4 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并測定含量，計算回收率。結果兒茶素平均為回收率為98.56%，RSD=1.3%(n=6)；沒食子酸平均回收率為100.53%，RSD=1.1%(n=6)；原兒茶酸平均回收率為98.34%，RSD=1.6%(n=6)。

2.2 提取工藝優化

以溶劑種類(因素A)、溶劑用量(因素B)、提取時間(因素C)為考察因素，設置因素水平，見表1。采用 L9(34)正交表進行試驗并進行方差分析，結果見表2和表3。在進行數據分析時，除表3所列的顯著性差異外，原兒茶酸(Ⅱ)含量的方差分析結果無顯著性差異。可見，各因素對3種成分提取的影響大小不同，對沒食子酸依次為B＞A＞C，對原兒茶酸依次為A＞C＞B，對兒茶素依次為A＞C＞B。溶劑種類比較時，雖然兒茶素在50%的甲醇提取物中含量最高，但分離困難、峰形很差，而水提物中沒食子酸、原兒茶酸含量最高；溶劑用量比較時，容積用10 mL時，原兒茶酸、兒茶素含量最高；提取時間比較時，提取30min時原兒茶酸、兒茶素含量最高。因此，確定最佳工藝條件為B1C3A1，即將10 mL水加入2 g鎖陽粉中，超聲提取30min。

表1 因素水平表

2.3 樣品含量測定

取鎖陽粉末(過40目篩)約2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入滅菌注射用水10mL，稱定質量，超聲處理30min，放冷，再稱定質量，離心(12 000 r/min)5 min，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，置棕色瓶中，即得。依上述方法制備7批供試品溶液，分別取配制好的對照品溶液和供試品溶液，精密吸取20 μL進樣，用峰面積按外標法計算鎖陽藥材、飲片中兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的含量。結果見表4。

表2 L9(34)正交試驗結果

表3 方差分析結果

2.4 最佳工藝驗證試驗

取3批樣品，按優選工藝提取，結果見表5。RSD＜2.5%，表明優選的提取工藝條件基本穩定。

表4 樣品含量測定結果(mg/g，n=2)

表5 最佳工藝驗證試驗結果(mg/g，n=3)

3 討論

在流動相的優化中，選用了乙腈-水系統的不同配比(25∶75，40∶60，10∶90，18∶82，5∶95，3∶97，4∶96，8∶92)，選用了甲醇-水系統的不同配比(20∶80，50∶50)，選用了乙腈-水-36%乙酸系統的不同配比(5∶95∶0.3，5∶95∶0.1，8∶92∶0.1，7∶93∶0.1，6∶94∶0.2，8∶92∶0.2)進行試驗。結果隨著乙腈體積分數的降低，兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的保留時間增加，乙酸的加入使峰形更好。當乙腈-水-36%乙酸為8∶92∶0.1時能夠獲得好的分離效果和短的分離時間，故選擇此流動相系統作為本試驗的流動相。

由于兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的含量差異較大，綜合評價時用3種成分的含量之和作為評價指標不夠科學、準確。9次正交試驗中，兒茶素的平均含量為5.939 mg/g，沒食子酸的平均含量是0.207 mg/g，原兒茶酸的平均含量是0.033 mg/g。用3種成分的含量之和作為評價指標時，更多地反映了含量較大的兒茶素的含量變化，有時會掩蓋含量較小的沒食子酸和原兒茶酸的含量變化。如何更好、更科學、更準確地評價和優化多種成分的提取工藝，有待進一步研究。

參考文獻：

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海人民出版社，1997:2 395.

[2]陶 晶，屠鵬飛.鎖陽莖的化學成分及其藥理活性研究[J].中國中藥雜志，1999，24(5):292-294.

[3]張遵義.原兒茶酸衍生物的化學結構與冠脈流量、心肌耗氧量關系的探討[J].藥學學報，1980，15(11):641-643.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥

科技出版社，2010:325.

[5]易生富，陳 兵，孫亞楠.正交試驗設計優化血脈通口服液水提工藝[J].醫藥導報，2014，33(3):382-385.

[6]張松亮，顧騰飛，于天杰.正交試驗法優選胃樂舒顆粒的醇提工藝[J].中國藥師，2014，17(1):165-167.