木薯渣混菌發酵替代麩皮飼料的研究

楊 婷，廖美德，劉偲嘉，賀玉廣，吳杰良

（華南農業大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣州 510642）

麩皮是小麥面粉廠的主要加工副產品，是重要的飼料原料[1]。用麩皮直接飼喂畜禽，其蛋白質的利用率不高，吸收率約為30%；膨化后飼喂，吸收率＞90%。麩皮水解液中含有五碳糖和六碳糖，能被酵母菌代謝利用，用此水解液培養酵母可獲得優質飼料蛋白質[2]。但近年來小麥種植面積持續下降，麩皮價格不斷上漲，成為制約其應用的重要因素[3]。

木薯渣不僅含有多種氨基酸和對動物體有益的維生素，而且產量豐富，價格低廉，作為新型飼料資源受到眾多科研人員的重視，并取得一定的階段性成果[4-7]。但木薯渣在飼料應用方面存在著不易貯存、蛋白質含量低和適口性差等弊端，限制其應用[8-9]。接種微生物，發酵木薯渣，利用微生物與相關化學物質發生的一系列復雜生物化學作用，可改變木薯渣的物理化學性質，從而解決上述弊端[10-11]。此外，發酵過程中還能殺死大部分有害微生物，如腸道寄生蟲等。同時，還可以提高粗蛋白質和粗脂肪的消化率，促進與細胞壁結合的礦物質吸收；提高小腸絨毛的完整性，促進小腸對營養物質的吸收[12]。

本研究利用優良的黑曲霉和釀酒酵母復配制成混合菌劑，通過微生物固體發酵工藝，探索最佳生料發酵條件，提高木薯渣蛋白質含量，改善適口性，為木薯渣的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木薯渣為廣畜動物藥業有限公司生產，產地為廣西。

菌株來源：釀酒酵母和黑曲霉，由華南農業大學資源環境學院實驗室保藏。

改良察氏培養基：土豆浸出液5%、蔗糖3%、硫酸鎂0.5%、氯化鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、硝酸鈉或硫酸銨0.4%。

酵母菌種子培養基1號：PDA液體培養基，一級種子培養基分裝到試管，二級種子培養基分裝到三角瓶。

酵母菌種子培養基2號：YPG液體培養基，含酵母浸粉0.5%、蛋白胨1.0%、葡萄糖2.0%，一級種子培養基分裝到試管，二級種子培養基分裝到三角瓶。

黑曲霉固體種子培養基：麩皮∶木薯渣∶水=1∶1∶1混合均勻。

所有培養基在“熟料”試驗時，115℃下蒸汽滅菌30min，待冷卻后備用；“生料”試驗時，不做濕熱滅菌處理，原料混合均勻即可接種。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌種子培養基篩選

選用PDA培養基和YPG培養基作為供試種子培養基，控制接種量均為一個單菌落，28℃下搖瓶培養24 h后，用血球計數板計算酵母菌細胞濃度。

1.2.2 氮源和不同初始水分選擇

選取硝酸鈉和硫酸銨作為供試氮源，添加量為0.4%，通過液體培養實驗（氮源0.4%+酵母菌1.5%+YPG培養基）和固體培養實驗[發酵底物為（木薯渣∶水=1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8）+氮源0.4%+酵母菌1.5%]，試驗用同一規格三角瓶進行，混合均勻后置于28℃培養箱培養，定時觀察生長情況并計數。

1.2.3 混菌發酵接種時間

木薯渣與水（70%）混合均勻后置于500mL三角瓶中，高壓滅菌（115℃，20min）后備用。先加入黑曲霉孢子懸浮液（2.5%），再設置4組間隔時間（1組 0 h、2組 12 h、3組 24 h和4組36 h）加入酵母菌（2.5%），混合均勻后置于28℃培養箱培養，定時觀察生長情況并計數。

1.2.4 氮源添加量的篩選

木薯渣培養基中硫酸銨的濃度共設置4個梯度（1組5%、2組10%、3組15%和4組20%），同時接入黑曲霉和酵母孢子懸浮液2.5%，混合均勻后置于28℃培養箱培養，定時觀察生長情況并計數。

1.2.5 磷酸鹽和糖蜜對木薯渣發酵的影響

設置兩組對立試驗，分別為添加磷酸鹽（0.2%）或糖蜜（2%）組，對照組為不添加磷酸鹽或糖蜜，其他培養條件不變，定時觀察生長情況并計數。

1.2.6 黑曲霉固體種子的可行性

采取薄布包裹的擴大培養方式，定量稱取培養好的黑曲霉固體種子（10%），混合均勻，其他培養條件不變，觀察生長情況并計數。

2 結果與分析

2.1 酵母菌種子培養基

不同培養基對酵母菌生長的影響見圖1。

圖1 不同培養基對酵母菌生長的影響

由圖1可知，YPG培養基中的酵母菌濃度比PDA培養基的高88%。同時，配制YPG時只需將3種試劑按比例添加混合均勻即可，操作比PDA的配制更為便捷，因此應選擇YPG培養基作為酵母菌種子培養基。此外，酵母菌的對數生長期約在培養12 h時出現，24 h后其自溶現象比較明顯，應在種子培養12～24 h內轉接到下一級培養，保證種子的濃度和活力。

2.2 氮源的選擇

2.2.1 液體培養實驗

不同氮源對酵母菌生長的影響見圖2。

圖2 不同氮源對酵母菌生長的影響

采用改良察氏培養基，選取硝酸鈉和硫酸銨作為供試氮源，添加量各為0.4%，28℃下搖瓶培養24 h，測定吸光度（OD600nm）。發現在液體培養試驗中，添加硫酸銨組的OD值比添加硝酸鈉的高，說明硫酸銨更能促進液體培養中酵母菌的生長。

2.2.2 固體培養實驗

不同氮源在不同初始水分下對酵母菌生長的影響見圖3。

圖3 不同氮源在不同初始水分下對酵母菌生長的影響

由圖3可知，以木薯渣為底物固體培養酵母菌，對比兩種氮源對酵母菌生長的影響。其中，硝酸鈉和硫酸銨的添加量均為3%，不同初始水分下培養48 h，血球板計數表明，不同水分梯度下兩組的酵母菌濃度相當，差異不顯著（P＞0.05）。因此，硝酸鈉和硫酸銨在固體培養中對酵母菌生長無顯著差異（P＞0.05）。

結果表明，雖然固體培養中氮源的影響差異不顯著（P＞0.05），但硫酸銨在培養基中很快解離為NH4+和SO42-，其中NH4+能直接被酵母菌等微生物吸收利用，SO42-能降低培養基的pH，抑制細菌生長，并且硝酸鈉的價格高于硫酸銨，所以硫酸銨更適宜作為木薯渣發酵的氮源。此外，從上述固體培養試驗可知，原料水分為70%，經過48 h培養后，酵母菌細胞濃度最高。

2.3 混菌發酵接種時間

不同間隔時間接入酵母菌對酵母菌生長的影響見圖4。

圖4 不同間隔時間接入酵母菌對酵母菌生長的影響

黑曲霉能產淀粉酶，將木薯渣中的多糖分解為還原糖，能較好地為酵母菌利用，同時黑曲霉能產酸降低pH，正好也是適合酵母菌生長的pH范圍。考慮到黑曲霉合成相關酶系需要時間，需探究延長接種酵母菌的必要性。混菌發酵，1組（0 h）、2組（12 h）、3組（24 h）、4組（36 h）分別表示在接入黑曲霉后，間隔0、12、24和36 h再接入酵母菌，培養期間，每12 h取樣一次檢測酵母菌細胞濃度。結果發現，同時接入黑曲霉和酵母菌的混菌發酵方式更有利于酵母菌生長，同時也能簡化接種操作。

相對于單菌發酵，混菌發酵能促進酵母菌的生長，表現為酵母菌細胞濃度較前者提高約20%，原因在于黑曲霉能產生相關酶系，降解淀粉和粗纖維含量。但在本試驗中也發現了另一問題，到培養后期時，各組酵母菌數量均有不同程度的下降。由于在三角瓶內培養，木薯渣培養基水分變化不大，對計數結果影響不大。其原因是黑曲霉在生長過程中逐漸生成孢子，抑制了酵母菌的生長。可適當調整兩者的接種量，以最適接種比例發酵，同時在培養過程中，多翻動培養基，打斷黑曲霉菌絲，延緩孢子生成。

2.4 氮源添加量

不同濃度的硫酸銨對酵母菌生長的影響見圖5。

微生物生長需要充足的氮源。氮源的配比主要影響發酵底物對礦質的營養及其理化性質。但是氮源濃度過低，合成不了足量的營養物質；氮源濃度過高，即使不影響菌株生長，也會因產品中的殘氮量過多降低養殖效果，并造成原料浪費。以硫酸銨為氮源，設置4個濃度梯度，即1組（5%）、2組（10%）、3組（15%）、4組（20%）。每隔12h測定酵母菌個數并觀察其生長情況。結果發現，4組的酵母菌生長曲線均呈先上升、后下降、最后趨于穩定的趨勢，拐點出現在36 h，此時黑曲霉菌絲生長旺盛。在培養后期，黑曲霉孢子的形成導致酵母菌數量下降后趨于平穩。

圖5 不同濃度的硫酸銨對酵母菌生長的影響

總體而言，當硫酸銨的添加量為5%時，酵母菌生長情況最佳，同時黑曲霉長勢也較好。考慮到最終發酵目的是使真蛋白質含量＞15%，原料中必須添加足夠量的無機氮源。按硫酸銨含氮量為21.21%，蛋白質平均含氮量為16%計算，要達到這個指標，木薯渣培養基中至少添加硫酸銨13%。綜合考慮，硫酸銨添加量最終定為15%。

2.5 磷酸鹽

磷酸鹽的添加對酵母菌生長的影響見圖6。

圖6 磷酸鹽的添加對酵母菌生長的影響

磷酸鹽提供金屬離子的同時，又可以對發酵底物起緩沖作用，對pH的影響很大。因此，選取磷酸二氫鈉作為供試磷酸鹽，設置對比試驗，即1組（無磷酸鹽）和2組（磷酸鹽0.5%），每隔24 h對酵母菌計數并觀察生長情況。結果發現，磷酸鹽的添加對酵母菌的生長影響不大，但能促進黑曲霉的生長。黑曲霉有更好的長勢，意味著相關酶的產出會更多，能進一步改良木薯渣的性質，因此，發酵過程應添加磷酸二氫鈉，添加量初步定為0.5%。

2.6 糖蜜

糖蜜對酵母菌生長的影響見圖7。

圖7 糖蜜對酵母菌生長的影響

糖蜜含有大量可發酵糖（主要是蔗糖），可用作酵母、味精、有機酸等發酵制品的底物或基料。試驗設置兩組，即1組（無糖蜜）、2組（糖蜜2%）每隔24 h對酵母菌計數并觀察生長情況。結果發現，糖蜜在木薯渣混菌發酵中的作用是加快酵母菌生長速度但不增加其數量，同時對黑曲霉生長無顯著的促進作用（P＞0.05）。

2.7 黑曲霉固體種子的可行性

接入黑曲霉固體種子對酵母菌生長的影響見圖8。

圖8 接入黑曲霉固體種子對酵母菌生長的影響

試驗發現，接種黑曲霉液體種子比較難控制接種量。為保證黑曲霉種子在木薯渣發酵培養基中能保持活力，并便于控制其接種量，應探究接種固體黑曲霉固體種子的可行性。采取薄布包裹的擴大培養方式，定量稱取黑曲霉固體種子。觀察生長期并定時計數。試驗發現，酵母菌的生長情況比在三角瓶中好，是因為擴大培養后通氣量增加，有利于酵母菌有氧呼吸，促進其增殖。培養到48和60 h時出現肉眼可見的白色菌絲和黑色孢子，說明接種黑曲霉固體種子是可行的。

3 討論

木薯渣發酵降解之后微生物含量和蛋白質含量增加，增加的蛋白質可能是淀粉酶和纖維素酶的一些細胞外分泌物，或者是細菌/真菌復合形成的單細胞蛋白質[13-14]。另外，降解可使氰化物含量下降，而營養成分（脂肪、粗纖維、灰分、礦物質）含量沒有變化。為了能更好的降解木薯渣粗纖維含量，提高飼料蛋白質含量，還有很多條件可以更進一步優化。可嘗試用產朊假絲酵母發酵，該菌種產蛋白質能力比較強[15]。實際生產中不便對原料滅菌，生料中的淀粉難以被酵母菌利用，配料時可用60℃的熱水拌料，達到淀粉糊化的效果，增加培養基中單糖的含量，改變培養基營養成分，以利于酵母菌生長[16]。黑曲霉是一種食用安全，能夠產生多種消化飼料的酶類，是常用的飼料復合酶產生菌，黑曲霉降解淀粉的能力比較強，但因其產黑色孢子，影響發酵產物外觀，而糖化酶對木薯渣的淀粉降解率為74.87%，可選擇工業糖化酶替代黑曲霉[17]。米曲霉的效果比黑曲霉要好，而且米曲霉所產的孢子偏黃綠色，對發酵產物外觀影響不大[18]。即可考慮采用“工業糖化酶+酵母菌+米曲霉”的混合培養方式發酵木薯渣。因此，為了不同需求可更進一步優化發酵工藝，以便將木薯渣的利用價值發揮到最大。

4 結論

本試驗對采用釀酒酵母菌和黑曲霉作為發酵菌株，對開發木薯渣發酵飼料進行了初步探究，主要內容為探討其發酵工藝條件，確定酵母菌以液體形式接入，其種子采用液體YPG培養基培養，12～24 h后轉接到下一級培養；黑曲霉以固體形式接入，其種子采用麩皮-木薯渣復合培養基培養。生料發酵工藝條件為硫酸銨15%、磷酸二氫鈉0.5%、底物水分70%，同時接入酵母菌和黑曲霉，接種量均為10%。24～48 h酵母菌即能到達最高生長濃度，且黑曲霉此后在60～72 h生成較多肉眼可見的黑色孢子，導致培養基整體發黑，影響其外觀，不利于做成飼料成品，因此將培養周期定為60 h。混菌發酵過程應及時翻動培養基，目的在于打斷菌絲以延緩黑曲霉孢子生成。

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