去鐵胺對促進擴張后皮瓣微循環重建的實驗研究

徐 偉，王春梅，楊思奮，代大毛

（東莞市康華醫院整形美容中心，廣東 東莞 523000）

去鐵胺對促進擴張后皮瓣微循環重建的實驗研究

徐 偉，王春梅，楊思奮，代大毛

（東莞市康華醫院整形美容中心，廣東 東莞 523000）

目的探討去鐵胺(Defemxamine，DFX)對擴張后皮瓣微循環重建的影響。方法將新西蘭大耳白兔24只分成實驗組和對照組，兔額部皮下植入圓柱形擴張器，制備蒂部位于耳根的矩形皮瓣，實驗組分別于模型制備后即刻、第3天、第5天將DFX注射于皮瓣末端，對照組皮下注射等量的生理鹽水，第7天分別進行皮瓣平均微血管數目及內徑、皮瓣組織中超氧化物歧化酶(MDA)、丙二醛(SOD)含量及血管內皮生長因子(VEGF)mRNA檢測。結果實驗組皮瓣SOD含量、VEGF mRNA表達高于對照組(P＜0.05)，平均微血管數目多于對照組(P＜0.05)，平均微血管內徑及MDA含量小于對照組(P＜0.05)。結論在擴張皮瓣的局部注射DFX，可以降低自由基水平，加快新生血管形成并促進皮瓣微循環重建。

去鐵胺；擴張皮瓣；丙二醛；超氧化物歧化酶；血管內皮生長因子

皮瓣移植在組織缺損修復和功能重建上發揮著不可替代的作用，適度的擴張后可以增強皮瓣的活力，但臨床上也常發生擴張術后Ⅱ期手術形成皮瓣(簡稱擴張皮瓣)時出現微循環重建障礙甚至壞死，影響治療效果，供血不足和缺血再灌流損是其中的兩個重要原因。去鐵胺(DFX)是一種鐵螫合劑，近年被發現具有清除氧自由基和激活缺氧反應基因等作用[1-2]，我們實驗通過將DFX皮瓣局部注射，觀察其對于擴張皮瓣微循環重建的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及分組 新西蘭大白兔24只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg(南方醫科大學動物中心提供)，氯胺酮(0.6 ml/kg體重)麻醉后取俯臥位，額部皮下潛行分離一腔，置入30 ml圓柱形皮膚軟組織擴張器，壺閥置于雙耳根間的皮下。術后第2天起，隔日向擴張器內注入生理鹽水5 ml，第14天取出擴張器，制備蒂部位于耳根，大小約為3 cm×5 cm的矩形皮瓣后原位縫回。模型制備后，將大白兔隨機分為兩組，每組12只，實驗組：分別于模型制備后即刻、第3天、第5天將DFX 100 mg/kg(根據前期的實驗確定為有效劑量)注射于距皮瓣末端1 cm和3 cm處達皮下層，對照組皮下注射等量的生理鹽水。

1.2 皮瓣相關指標的檢測

1.2.1 平均微血管數目及內徑 矩形皮瓣形成后第7天于皮瓣遠端組織2.0 cm處取約0.5 cm×1.0 cm大小的全層組織，對半均分，一半用于測定MDA、SOD。將組織10%甲醛固定，常規石蠟包埋，HE染色，在10×40高倍鏡下隨機選取5個視野，通過醫學圖文數字系統軟件計數微血管數目，所計數血管中必須有紅細胞，并同時測量管徑大小，各組計算平均數。

1.2.2 測定皮瓣組織中MDA、SOD的含量 將取出的另一半皮瓣組織稱重，加9倍重的冰生理鹽水，用超聲勻漿機制成10%勻漿液。各取勻漿液0.1 ml， SOD活性(黃嘌呤氧化酶法)及丙二醛含量(硫代巴比妥酸比色法)測定均按試劑盒方法測定。MDA單位以nmol/10 mg濕重表示，SOD活性換算成nmol/mg濕重表示。

1.2.3 血管內皮生長因子(VEGF)mRNA檢測 各取10%組織勻漿液0.1 ml，Trizol提取總RNA，并逆轉錄為cDNA用于PCR擴增。VEGF引物序列：上游引物：5'-CAC TGG ACC CTG GCT TTA CT-3'，下游5'-TGC TGG CTT TGG TGA GGT T-3'，擴增產物320 bp；內參GAPDH引物：上游：5'-TTA CTT GGA GGC CAT GTG GGC C-3'，下游：5'-ACT GCC ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3'，擴增產物463 bp，PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后，以凝膠成像分析儀分析各條帶灰度值。各個反應體系以GAPDH為內參照，計算灰度比值作為VEGF mRNA的表達值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學處理。計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組平均皮瓣成活率、微血管數目、微血管內徑比較 實驗組皮瓣平均成活率顯著高于對照組(P＜0.05)，平均微血管數目多于對照組(P＜0.05)，平均微血管內徑小于對照組(P＜0.05)，實驗組微血管豐富，多為管徑較小新生血管；對照組微血管較少，多為管徑較大固有血管。見圖1、表1。

圖1 術后7 d皮瓣組織學觀察（×400倍）

表1 兩組微血管數目、微血管內徑、MDA和SOD含量VEGF-mRNA表達的比較(n=12，)

表1 兩組微血管數目、微血管內徑、MDA和SOD含量VEGF-mRNA表達的比較(n=12，)

組別實驗組對照組t值P值平均微血管數目(個) 30.81±2.53 10.40±1.72 4.270 0.005平均微血管內徑(mm) 22.58±4.36 113.20±19.87 1.084 0.000 MDA含量(nmol/10 mg) 3.83±0.47 6.13±0.83 0.393 0.001 SOD含量(nmol/mg) 311±65.87 224±27.12 1.097 0.003 VEGF-mRNA表達1.15±0.16 0.51±0.12 0.425 0.000

2.2 各組皮瓣組織中MDA、SOD的含量 術后7 d，實驗組MDA含量低于對照組(P＜0.05)，SOD含量明顯高于對照組(P＜0.05)，見表1。

2.3 各組皮瓣組織中VEGF mRNA的表達 電泳后各泳道均可見特異性條帶，與DNA標記進行比較，產物大小與預期一致，實驗組VEGF mRNA表達明顯高于對照組(P＜0.05)，見圖2。

圖2 術后7 d皮瓣VEGF mRNA表達

3 討 論

近年來的研究證實，氧自由基是皮瓣缺血/再灌損傷中的主要介質[3]。在缺血缺氧的過程中，首先產生的氧自由基為過氧化氫和超氧陰離子，這些氧自由基在水溶液中的毒性不太大，對組織損傷輕。然而，在有鐵離子存在時，上述氧自由基可轉化成為羥自由基和其他反應性鐵一氧復合物等毒性較大的氧自由基，容易導致細胞膜的脂質過氧化反應，產生脂質過氧化物，如丙二醛(MDA)、酮基、氫過氧基以及新的氧自由基等，且損傷程度與局部鐵離子濃度成正比。氧自由基不但通過對生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化作用引起細胞損傷，而且還能通過脂質過氧化分解代謝產物MDA，促使蛋白質交聯聚合反應引起細胞代謝和功能障礙，甚至細胞死亡[4]。在本實驗中，通過測定MDA含量來反映過氧化脂質，間接地反映氧自由基的產生情況。SOD是存在于體內的一種重要的氧自由基清除劑，SOD活性可反映機體清除氧自由基的能力。我們觀察到，應用DFX后，皮瓣組織MDA含量明顯降低，SOD升高，說明DFX能降低組織中自由基水平，增強抗氧化能力，從而有利于皮瓣遠端缺血細胞，特別是存活與壞死交界區域的“臨界”向存活的方向轉化。這可能是因為DFX對游離鐵離子的螯合作用有利于減少由鐵離子參與的自由基產生，減輕了自由基對缺氧細胞的進一步損害[1]。

擴張皮瓣微循環重建與新生血管形成有關，而新生血管形成與VEGF有密切聯系。實驗證明，內源性VEGF對皮瓣的成活起重要作用[5]。VEGF是目前發現的最重要的血管生長因子之一，是內皮細胞特異的強效有絲分裂原，與內皮細胞上相應的受體結合，引起新的內皮細胞增殖、分化并形成管腔樣結構；同時促內皮細胞產生并調節纖維蛋白溶酶原的激活因子和抑制因子，在血管生成中對基底膜細胞基質的降解具有重要作用；此外還可以增加血管通透性，使內皮細胞接受刺激因子的作用增加，同時血漿外滲，形成血管生成的臨時基質，有利于血管生成，被認為是血管生成的先決條件[6]。我們發現，實驗組新生血管增生顯著并與VEGF表達上調一致，提示DFX通過誘導VEGF的表達而促進新生血管形成，這與Langlois等[7]的研究結果一致。誘導缺氧因子(HIF-1)是缺氧反應信號通路的調控因子，由HIF-lα和HIF-1β兩個亞基組成。HIF-lα既是HIF-1調節亞基又是活性亞基，缺氧能促進HIF-lα表達上調，上調的HIF-lα和HIF-1β結合成HIF-1，HIF-1通過作用于靶基因的缺氧反應元件調控VEGF等靶基因的表達，在缺氧缺血性組織損傷后的血管生成方面發揮重要作用。DFX在缺氧條件下能，誘導HIF-1基因表達，增加HIF-1與DNA結合活性，促進HIF-1α表達，從而上調VEGF的表達，促進新生血管的形成[8-9]。

DFX用于臨床多年，是一種比較安全有效的藥物，但作用于皮瓣的研究較少，本實驗發現在擴張皮瓣局部注射DFX，可以降低自由基水平，加快新生血管形成促進皮瓣微循環重建，從而增加皮瓣存活率，但其最佳作用時間、劑量及分子機制上還有待進一步研究。

[1]Moridani MY,Pourahmad J,Bui H,et al.Dietary flavonoid iron complexes as cytoprotective superoxide radical scavengers[J]. Free Radic Biol Med,2003,34(2):243-253.

[2]Hamrick SE,McQuillen PS,Jiang X.A role for hypoxia-inducible factor-1 alpha in desferoxamine neuroprotection[J].Neurosci Lett, 2005,379(2):96-100.

[3]Prada FS,Arrunategui G,Alves MC,et al.Effect of allopurinol,superoxide-dismutase,and hyperbaric oxygen on flap survival[J].Micro Surgery,2002,22(8):352-360.

[4]陳 暖,周 玫.自由基醫學[M].北京:人民衛生出版社,1993: 13-54,142-145.

[5]韓雪峰,李健寧,楊大平,等.跨區供血皮瓣成活過程中血管構筑及內源性VEGF變化的實驗研究[J].中國美容醫學,2008,17(2):232-234.

[6]Huang N,Khan A,Ashrafpour H,et al.Efficacy and mechanism of adenovirus-mediated VEGF-165 gene therapy for augmentation of skin flap viability[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291 (1):127-137.

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[8]Hamrick SE,McQuillen PS,Jiang X.A role for hypoxia-inducible factor-1 alpha in desferoxam-ine neuroprotection[J].Neurosci Lett,2005,379(2):96-100.

[9]Prass K,Ruscher K,Karsch M,et al.Desferrioxamine induces delayed tolerance against cerebral ischemia in vivo and in vitro[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(5):520-525.

Experimental study on promoting reconstruction of microcirculation of expanded skin flap with defemxamine.

XU Wei,WANG Chun-mei,YANG Si-fen,DAI Da-mao.
Center of Plastic and Cosmetic Kanghua Hospital of Dongguan, Dongguan 523000,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the effects of Deferoxamine(DFX)on the reconstruction of microcirculation of expanded skin flap.MethodsA total of 24 rabbits were divided r andomly into experimental groups and control group.The cylindrical expander was implanted into frontal subcutaneous of the rabbits and rectangular pedicle skin flap was prepared.In the experimental group,the end of the flap was injected with DFX(100 mg/kg)immediately,3rdand 5thdays respectively after the model of preparation;The same dose of normal saline was injected in the control group.On day 7,the mircrovessels was evaluated under the microscope,activity of superoxide dismutase(SOD),content of malondialdehyde(MDA)and VEGF mRNA expression were measured.Result Compared with the control group,SOD activity and Vascular endothelial cell growth factor(VEGF)mRNA expression rised,microvascular density increased(P＜0.05),MDA content and microvascular diamete decreased in the experimental groups(P＜0.05). Conclusion DFX can reduce oxygen free radicals level and accelerate angiogenesis to promote reconstruction of microcirculation of expanded skin flap.

Defemxamine;Expanded skin flap;Malondialdehyde;Superoxide dismutase;Vascular endothelial cell growth factor

R-332

A

1003—6350（2014）09—1259—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0489

2014-02-20)

東莞市科技局科研立項（編號：20121051059233）

徐 偉。E-mail：xuwei10086@163.com