展神經(jīng)損傷后神經(jīng)核內神經(jīng)再生的研究

張 毅，周凌云，虞 昊

(1.南通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南通 226001；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001)

·論 著·

展神經(jīng)損傷后神經(jīng)核內神經(jīng)再生的研究

張 毅1，周凌云2，虞 昊1

(1.南通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南通 226001；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的探討展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內神經(jīng)再生的情況。方法選用健康雄性Beagle犬4只，經(jīng)顳底入路顯微手術，解剖、暴露展神經(jīng)腦池段行展神經(jīng)切斷，并測定展神經(jīng)功能。術后連續(xù)7 d靜脈注射BrdU，術后28 d灌注取材，犬腦行冠狀位冰凍切片。行nestin/BrdU、DCX/BrdU、GFAP/BrdU免疫熒光雙標檢測。結果Beagle犬眼球呈內斜視，損傷側展神經(jīng)核內可見nestin/BrdU陽性神經(jīng)前體細胞，DCX/BrdU陽性新生神經(jīng)元前體細胞以及GFAP/BrdU陽性星形膠質細胞。對側展神經(jīng)核內未見相關陽性細胞。結論展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內出現(xiàn)神經(jīng)再生現(xiàn)象。

展神經(jīng)損傷；展神經(jīng)核；神經(jīng)再生

展神經(jīng)為第Ⅵ對腦神經(jīng)，全程走行復雜，經(jīng)過并毗鄰許多重要結構，如Dorello管、海綿竇、眶上裂等，與頸內動脈、交感神經(jīng)、Gruber韌帶、巖下竇等結構聯(lián)系密切。顱內炎癥、腫瘤、外傷、顱內高壓、眼部病變常導致展神經(jīng)損傷，嚴重影響患者的生活質量。以往認為腦神經(jīng)損傷后不能再生[1]，但近年來眾多學者研究發(fā)現(xiàn)一些腦神經(jīng)損傷后也有再生現(xiàn)象[2-4]。本文對展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內是否有神經(jīng)再生現(xiàn)象進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Beagle犬4只(南通大學動物實驗場提供)，年齡1～2歲，體重10～20 kg，體長70～100 cm。許可證號：SCXK(蘇)：2008-0010。每只籠內最多飼養(yǎng)1只，實驗前、后在標準實驗條件下飼養(yǎng)。

1.2 展神經(jīng)損傷模型制備 術前12 h禁食，4 h禁水，腹腔內注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)麻醉。將Beagle犬置于側臥位，頭向對側旋轉，頭部置于頭圈上，耳緣牽向中線和尾側。常規(guī)消毒、鋪巾，開顱皮瓣翻向外側并縫線固定。于顳肌附著處切開顳肌，在顳骨上保留一小片顳肌附著緣，以便關顱時縫合。顳底入路開顱，骨窗要盡量靠近顱底，用高速梅花鉆和顯微咬骨鉗形成從眶后到顴弓前足夠大骨窗，擴大約3.0 cm×3.0 cm(圖1)，即可沿骨窗下緣切開硬膜并放射狀剪開。通過向內、上方牽拉顳葉牽開腦組織，磨除巖骨前部，可見深部的展神經(jīng)(圖2)，穿過腦橋前池，在神經(jīng)切斷后應用雙極電凝處理神經(jīng)斷端，并將近側端翻向腦干方，術中給予生理鹽水500 ml+慶大霉素16萬U靜脈滴注，術后當天開始連續(xù)3 d肌肉注射青霉素160萬U。保證實驗室溫度在25℃左右，術中注意動物保暖。

1.3 BrdU靜脈注射 術后每條犬靜脈注射BrdU 50 mg/kg，2次/d(早7時和晚7時)，連續(xù)7 d。

1.4 組織固定及切片 術后28 d犬麻醉后，開胸經(jīng)心灌注生理鹽水及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS(pH 7.2)，取腦后固定6 h。再分別經(jīng)20%、30%蔗糖平衡，行冠狀位冰凍連續(xù)切片，片厚20μm。共收集各犬展神經(jīng)核部位前、中、后3套切片，均貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上待染色。

圖1 顳底入路骨窗

圖2 展神經(jīng)(箭頭示)

圖3 展神經(jīng)損傷后眼球位置

圖4 Nestin（綠）/BrdU（紅）免疫熒光雙標檢測損傷側展神經(jīng)核內神經(jīng)前體細胞。損傷側展神經(jīng)核內出現(xiàn)Nestin/BrdU免疫熒光陽性神經(jīng)前體細胞（箭頭）

圖5 DCX（綠）/BrdU（紅）免疫熒光雙標檢測損傷側展神經(jīng)核內新生神經(jīng)元前體細胞。損傷側展神經(jīng)核內出現(xiàn)DCX/BrdU免疫熒光陽性新生神經(jīng)元前體細胞（箭頭）

圖6 GFAP（綠）/BrdU（紅）免疫熒光雙標檢測損傷側展神經(jīng)核內新生星形膠質細胞，損傷側展神經(jīng)核內出現(xiàn)GFAP/BrdU免疫熒光陽性星形膠質細胞（箭頭）

1.5 免疫熒光 取上述切片，用0.01 mol/L PBS (pH 7.2)漂洗后，每張切片滴加10%山羊血清50 μl封閉過夜，然后用一抗孵育：兔抗-BrdU(1:100，Abcam)、鼠抗-nestin(1:2000，Millipore)、豚鼠抗DCX(1:1000，Millipore)、鼠抗-GFAP(1:500，Millipore)，4℃濕盒孵育24 h，用0.01 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗3遍，在避光條件下，用二抗孵育：結合有Alexa Fluor 594的羊抗兔二抗(1:1000，Molecular Probes)、結合有Alexa Fluor 488的羊抗鼠或豚鼠的二抗(1:200，invitrogen)4℃濕盒孵育24 h，在避光條件下，PBS洗片3遍后中性甘油封片。熒光顯微鏡下觀察陽性的免疫熒光細胞并攝片。

2 結 果

2.1 展神經(jīng)損傷后功能測定 所有存活Beagle犬術后均生存良好，無感染、角膜潰瘍等并發(fā)癥，展神經(jīng)切斷后，損傷后犬眼球始終呈內斜視(圖3)，無其他神經(jīng)功能障礙征象。

2.2 免疫熒光檢測

2.2.1 Nestin/BrdU免疫熒光雙標檢測 術后28 d，對雙側展神經(jīng)核進行nestin/BrdU免疫熒光雙標檢測，損傷側展神經(jīng)核內可見到nestin/BrdU免疫熒光雙標陽性神經(jīng)前體細胞(圖4)，而對側展神經(jīng)核內未見到nestin/BrdU免疫熒光雙標陽性神經(jīng)前體細胞。展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內出現(xiàn)了具有再生潛能的神經(jīng)前體細胞。

2.2.2 DCX/BrdU免疫熒光雙標檢測 術后28 d，對雙側展神經(jīng)核進行DCX/BrdU免疫熒光雙標檢測，損傷側展神經(jīng)核內可見DCX/BrdU免疫熒光雙標陽性新生神經(jīng)元前體細胞(圖5)，而對側展神經(jīng)核內未見到DCX/BrdU免疫熒光雙標陽性細胞。展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內出現(xiàn)的神經(jīng)前體細胞，可能具有向神經(jīng)元分化的能力。

2.2.3 GFAP/BrdU免疫熒光雙標檢測 術后28 d，對雙側展神經(jīng)核進行GFAP/BrdU免疫熒光雙標檢測，損傷側展神經(jīng)核內可見GFAP/BrdU免疫熒光雙標陽性的新生星形膠質細胞(圖6)，而對側展神經(jīng)核內未見到GFAP/BrdU免疫熒光雙標陽性細胞。這一部分的陽性細胞可能是損傷后膠質增生而來，也可能是展神經(jīng)損傷后展神經(jīng)核內出現(xiàn)的神經(jīng)前體細胞分化而來。

3 討 論

顱腦神經(jīng)損傷比較常見，除原發(fā)自顱神經(jīng)的病變外，顱骨及腦內病變，眼部病變也多侵及腦神經(jīng)，如海綿竇內病變或直接手術的腦神經(jīng)損傷發(fā)生率高達22%～61%[5]。腦神經(jīng)主要位于顱內深部，經(jīng)顱底多個孔裂進出顱腔，除與腦干連接處外，整段腦神經(jīng)均走行在蛛網(wǎng)膜下腔的腦脊液(CSF)內，未被其他組織支持包繞，故其抵抗牽拉和機械外力的能力遜于其他周圍神經(jīng)。另外，顱神經(jīng)的血供較單一，主要來自軟腦膜上的動脈，且多與腦重要功能區(qū)、主要動、靜脈關系密切；CSF內的代謝終產(chǎn)物、炎細胞及CSF對斷裂神經(jīng)遠端分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子的稀釋作用均給損傷后修復帶來較大障礙。

腦神經(jīng)損傷處與神經(jīng)元胞體的距離非常接近，一般在數(shù)厘米左右[6-7]。有研究表明，神經(jīng)損傷處與神經(jīng)元胞體的距離和軸突再生能力呈負相關，此點也是腦神經(jīng)再生修復能力明顯低于其他周圍神經(jīng)的重要原因[8]。諸多學者已經(jīng)展開相關腦神經(jīng)損傷后的再生修復研究工作，并且認為腦神經(jīng)損傷后具有一定的自我再生能力[2-4]。

展神經(jīng)組織學由于缺乏神經(jīng)外膜、基底膜和牢固的神經(jīng)束膜包被，僅被1～2層髓鞘細胞包繞，膠原蛋白含量明顯低于其他周圍神經(jīng)，且缺少用于連接神經(jīng)束的結締組織，給修復和重建帶來一定困難[6-7]。那么展神經(jīng)損傷后是否也具有一定自我再生修復能力則未見報道。本研究觀察到，犬展神經(jīng)損傷后28 d，損傷側展展神經(jīng)核內有nestin/BrdU免疫熒光雙標陽性神經(jīng)前體細胞，而且有新生的DCX/BrdU免疫熒光雙標陽性神經(jīng)元前體細胞以及GFAP/BrdU免疫熒光雙標陽性星形膠質細胞。說明展神經(jīng)損傷后，具有一定的自我再生的能力，出現(xiàn)的神經(jīng)前體細胞能夠向神經(jīng)元以及星形膠質細胞分化。這些新生的細胞可能參與了展神經(jīng)的再生過程。

神經(jīng)再生過程復雜，涉及的因素眾多，如何提高展神經(jīng)損傷后自我再生的能力以助于展神經(jīng)的修復有待于我們今后進一步研究。

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[8]Dubuisson A,Kline DG.Indications for peripheral nerve and brachial plexus surgery[J].Neurol Clin,1992,10(4):935-951.

Study of the neural regeneration in the abducens nucleus after abducens nerve injury.

Z HANG Yi1,ZHOU Ling-yun2,YU Hao1.
1.Department of Neurosurgery,Second Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong, 226001,Jiangsu,CHINA;2.Department of Acupuncture,the First Affliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,Heilongjiang,CHINA

ObjectiveTo explore the neural regeneration in the abducens nucleus after abducens nerve injury.MethodsFour healthy male Beagle dogs were selected and subtemporal approach was adopted.By using microsurgery to expose the cisternal segment of the abducens nerve,the abducens nerve was cut and function test was measured.Dogs were injected with BrdU at 1 to 7 days post-injury to allow identification of differentiated cells and sacrificed at 28 days for immunofluorescence of nestin/BrdU,DCX/BrdU,GFAP/BrdU.ResultsOcular motility disorders caused by abducens nerves injury emerged in the injured eye of Beagle dogs.Nestin/BrdU double positive neural progenitor cells,DCX/BrdU double positive newborn neuronal progenitor cells and GFAP/BrdU double positive newborn astrocytes were found in the abducens nucleus after abducens nerve injury.Conclusion Neural regeneration occurred in the abducens nucleus of Beagle dogs with abducens nerve injury.

Abducens nerve injury;Abducens nucleus;Neural regeneration

R-332

A

1003—6350（2014）09—1249—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.09.0486

2014-02-12)

黑龍江省自然科學基金項目(編號：ZD201211)；南通市社會事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計劃項目(編號：HS2012031)

張 毅。E-mail:zhangyi9285@sina.com