HMGB1基因多態性與HBV相關性肝癌的關聯性研究

王丹　鄧春青　趙龍鳳

【摘要】 目的：探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）第4內含子1176G/C與HBV感染后肝癌是否存在關聯。方法：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）方法檢測110例HBV感染后肝癌患者及316例HBV感染后非肝癌患者HMGB1 1176G/C多態性，采用 字2檢驗及非條件logistic回歸統計方法進行分析。結果：乙肝肝癌組3種基因型及G、C等位基因分布與慢性乙型肝炎組比較差異有統計學意義（字2=6.152，P=0.046；字2=5.605，P=0.018）。在顯性模式下乙肝肝癌組與慢性乙型肝炎組比較差異有統計學意義（P=0.023），在隱性模式下與乙肝病毒攜帶組、輕型肝病組比較差異有統計學意義（P=0.048，P=0.028），在共顯性模式下與輕型肝病組比較差異有統計學意義（P=0.03）。結論：HMGB1基因多態性與HBV感染后肝癌易感性相關。

【關鍵詞】 高遷移率族蛋白B1； 單核苷酸； 乙型肝炎病毒； 多態性； 肝癌細胞

The Correlation of Genetic Polymorphisms of HMGB1 to Hepatitis B Virus-related Hepatocellular Carcinoma/WANG Dan，DENG Chun-qing，ZHAO Long-feng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：013-016

【Abstract】 Objective： To study the possible association of the genetic polymorphism of high mobility group protein B1 （HMGB1） 1176 G/C intron 4 with the susceptibility to hepatocellular carcinoma （HCC）after hepatitis B virus （HBV） infection. Method： 110 patients with HBV-related HCC and 316 patients of HBV infection without HCC after HMGB1 intron4 1176G/C polymorphism were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length pdymo-rphism（PCR-RFLP）method， chi-square test and unconditioned logistic regression model were applied to analysis results. Result： There were significant statistically difference in the three genotypes among the HBV-related HCC group and the chronic HBV infection group（字2=6.152，P=0.046；字2=5.605，P=0.018）. There were significant difference （P=0.023） between HCC and CHB under the dominant model either， hepatitis group of AsC，AsC+CHB different from HCC group（P =0.048， 0.028） under the recessive model respectively. There were significant difference between HCC and AsC+CHB under codominant model（P=0.03）. Conclusion： The results suggested that the genotype of HMGB1 intron4 1176 G/C is associated with the susceptibility to HBV-induced hepatocellular carcinoma.

【Key words】 High mobility group protein B1； Mononucleotide； Hepatitis B virus； Polymorphisms； Hepatocellular carcinoma

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.005

原發性肝癌（HCC，簡稱肝癌）是我國最常見的惡性腫瘤之一，尤以東南沿海地區多見，自20世紀90年代以來已上升為惡性腫瘤的第2位，全國每年13萬人死于肝癌，其中約有1/3的患者有乙肝病史[1-2]。HBV感染遺傳易感性的相關基因已被不斷發現[3-5]。在HCC發病的相關因素中，遺傳易感性同樣起著重要作用，與之有關的基因多態性指標有：GST、VDR、IL28B、HLA、STAT4、CXCL14等[6-11]。深入研究HBV及HCC遺傳易感性的分子機制對降低HCC的發病率及死亡率水平均具有重要意義。HMGB1是一類非組蛋白染色體結合蛋白，具有誘導炎性反應，調控基因轉錄，調節免疫等多種功能。大量實驗證明，HMGB1參與了肝癌的發生發展過程[12-13]。HMGB1基因多態性與多種疾病的遺傳易感性相關，但與HBV感染背景下HCC的發生是否有關聯，目前報道甚少[14-19]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 426例HBV感染者均為本院門診及住院患者，男334例，女92例，年齡（42.15±11.87）歲，均為漢族，且無親緣關系。所有病例診斷符合2005年中華醫學會肝病與感染病學分會修訂的病毒性肝炎診斷標準，同時排除HIV、TP及其他肝炎病毒感染。樣本收集均獲患者知情同意。按疫病類型將患者分為四組，其中乙肝病毒攜帶組98例，男62例，女36例；慢性乙型肝炎組116例，男92例，女24例；乙肝硬化組102例，男86例，女16例；乙肝肝癌組110例，男86例，女24例。

1.2 基因組DNA的提取 采用硅膠柱純化方式，從700 ?L抗凝血液中提取淋巴細胞基因組DNA。UV計測定DNA濃度及純度，并將樣本稀釋至10 ng/?L，分裝保存。

1.3 PCR-RFLP 從SNPs數據庫下載SNP的標準序列，Primer Premier 6.0軟件設計引物：上游：5-3CCTTTGCCCAGTGTATC，下游：5-3TGTATGCCAAGCCATTTG（上海英濰捷基公司合成），內切酶BclI位點T/GATCA（NEB公司提供）。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環次數35次，72 ℃延遲5 min結束PCR反應。產物37 ℃過夜酶切，65 ℃ 30 min，終止反應。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，送上海英濰捷基公司測序驗證。

1.4 統計學處理 SPSS 17.0軟件進行數據處理，計算等位基因頻率和基因型頻率，Hardy-Weinberg平衡檢驗及各組間比較均采用 字2檢驗，以P>0.01表示符合H-W平衡，以P<0.05表示各組間比較差異有統計學意義，非條件Logistic回歸校正年齡及性別等因素，進行關聯分析，計算比值比（Odds Ratios， OR）及其95%可信區間（Confidence Intervals， CI）表示相對危險度。

2 結果

2.1 基因型的判定及測序驗證 PCR產物及酶切產物見圖1～2。

2.2 H-W平衡判定及各基因型、等位基因的頻率分布 診斷明確的乙型肝炎患者總計426例，樣本經 字2檢驗，P=0.85，統計學檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，具有代表性，見表1。GG、CC和GC 3種基因型頻率及G、C等位基因頻率在樣本中的分布比較差異無統計學意義（P=0.113，P=0.104）。乙肝肝癌組GG基因型頻率低于乙肝攜帶組、乙肝肝硬化組、慢性乙型肝炎組，與前兩組比較差異無統計學意義（P=0.086，P=0.285），與慢性乙型肝炎組比較差異均有統計學意義（字2=6.152，P=0.046）；GC、CC基因型頻率高于其余三組，僅與慢性乙型肝炎組比較差異有統計學意義（P=0.046）。慢性乙型肝炎組G等位基因頻率高于乙肝肝癌組，比較差異有統計學意義（字2=5.605，P=0.018）；C等位基因頻率低于其余三組，僅與乙肝肝癌組比較差異有統計學意義（P=0.018）。

根據非條件Logistic回歸校正年齡、性別混雜因素，以乙肝肝癌組為病例組分別與其他組比較進行分層分析，HMGB1基因位點1176G/C基因多態性在乙肝肝癌組與乙肝攜帶者組比較差異有統計學意義（OR=0.301，95%CI：0.092-0.989，P=0.048，Recessive model）；乙肝肝癌組與慢性乙型肝炎組（OR=3.792，95%CI：1.206-11.919，P=0.023，Dominant model）比較差異有統計學意義；肝癌組與輕型肝病組（乙肝病毒攜帶組+慢性乙型肝炎組）（OR=0.227，95%CI：0.061-0.852，P=0.028，Dominant model；OR=0.225，95%CI：0.058-0.866，P=0.03，Codominant model）比較差異有統計學意義，見表2。

3 討論

原發性肝癌的發生機制復雜，病因尚未確定，目前主要認為與肝炎病毒、致癌物質、飲水污染、寄生蟲病等眾多環境因素及遺傳因素有關。肝癌有明顯的家族聚集現象，其本質是因為遺傳因素和肝癌之間存在明顯的相關性。通過遺傳學和表觀遺傳學改變引起原癌基因活化和抑癌基因滅活是導致肝癌發生的重要生物學過程。我國學者發現人體內存有導致肝癌的易感基因，此舉拉開了研究肝癌相關易感基因的帷幕[20]。

HMGB1基因位于13q12染色體上，編碼產物HMGB1已被證實參與了HBV感染后肝癌發生的過程，Yan等[12]指出HMGB1通過激活TLR4和RAGE信號通路，促進肝癌的浸潤和轉移。Jiang等[13]發現HMGB1 mRNA及蛋白在肝癌組織中表達最高，指出HMGB1的過度表達是肝癌發病的一個重要因素。繼Kornblit等[14]人首次報道HMGB1基因總共存在6個SNP和4種基因突變后，其基因多態性與SIRS、同種異體T細胞移植免疫反應、產后膿毒癥、MODS等多種疾病的相關性已被陸續報道[15-18]。Deng等[19]在研究HMGB1 1176G/C多態性與HBV感染臨床表型的關聯性分析中指出GG基因型人群對慢性乙型肝炎、肝硬化、急性乙型肝炎的易感性高于CC、GC基因型人群，G等位基因的HBV感染風險明顯高于C等位基因，但與HBV感染后肝癌的關聯性未予報道。

本研究結果提示，HMGB1 intron4 1176G/C多態性與HBV感染后HCC的發生有關聯。攜帶GG基因型的人群對HBV感染后HCC的患病風險度增加，該慢性乙型肝炎人群更易發展成乙肝后肝癌，而攜帶CC基因型的人群感染HBV后發生HCC的風險較低。G等位基因不僅與HBV感染嚴重肝病密切相關，而且與HBV感染后肝癌的發生相關。HBV感染后HCC的發生，影響因素繁多，遺傳背景尤為復雜。在分析其與HMGB1基因多態性的關聯性時，種族和地域的差異、樣本量不足、來源局限、等位基因連鎖不平衡現象、基因突變特征、其他微效基因的相關影響、環境及宿主因素等諸多因素均可干擾研究結果，要考證其準確性，仍需要多中心、大樣本的臨床觀察及研究。

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（收稿日期：2014-02-12） （本文編輯：黃新珍）

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