Annexin5、ET－1、vWF在子癇前期患者胎盤中的表達

任春麗，唐興國，任 磊

（1.承德醫學院附屬醫院產科；2.承德職業護理學院解剖教研室；3.承德醫學院附屬醫院兒科，河北承德067000）

Annexin5、ET－1、vWF在子癇前期患者胎盤中的表達

任春麗1，唐興國2，任 磊3

（1.承德醫學院附屬醫院產科；2.承德職業護理學院解剖教研室；3.承德醫學院附屬醫院兒科，河北承德067000）

目的 研究子癇前期患者胎盤中Annexin5、ET－1、vWF的表達水平，并探討子癇前期發病機制。方法 采用免疫組化方法檢測子癇前期患者84例（輕度29例、早發重度型27例、晚發重度型28例）及對照組29例胎盤組織中Annexin5、ET－1、vWF的表達水平。結果 ①胎盤中Annexin 5在子癇前期各組表達強度明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。雖表達強度早發型＜晚發型＜輕度組，但各組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。②胎盤中ET－1在子癇前期各組表達強度明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而子癇前期患者各組間隨病情的加重ET－1水平呈上升趨勢，早發型＞晚發型＞輕度子癇前期患者，差異仍有統計學意義（P＜0.05）。③胎盤vWF在癇前期各組中表達明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；重度子癇前期組（早發型與晚發型）顯著高于輕度子癇前期組，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；而早發型重度子癇前期組與晚發型重度子癇前期組比較，雖早發型胎盤組織vWF的表達雖有增高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 胎盤中Annexin 5、ET－1、vWF的表達可能與子癇前期發病機制有關，通過影響胎盤中凝血－纖溶系統及血管內皮系統，參與子癇前期發生、發展的病理生理過程。

子癇前期；Annexin 5；ET－1；vWF；免疫組化

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1141）

子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠期特有的疾病，是導致孕產婦及圍產兒發病率及死亡率升高的主要原因。目前子癇前期的病因尚不明確。研究表明子癇前期基本病理生理變化是全身小血管痙攣，內皮損傷及局部缺血。全身各系統各臟器灌流減少，導致各系統嚴重受損，對母兒造成危害，甚至導致母兒死亡［1］。膜聯蛋白5（annexin5）被認為通過凝血系統和抗凝血系統的失衡致胎盤缺血缺氧相關，而血管性假血友病性因子（von Willbrand Factor，vWF）和內皮素1（ET－l）是血管內皮損傷重要的標記物。本研究通過免疫組化方法檢測子癇前期患者胎盤中Annexin5、ET－1、vWF表達，探討An－nexin5、ET－1、vWF與子癇前期發病的關系。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選取2010年10月—2011年10月承德醫學院附屬醫院產科住院的患者113例，其中子癇前期患者84例，分為輕度子癇前期組（mPE）、早發型重度子癇前期組（EOSP）、晚發型重度子癇前期組（LOSP）。mPE患者29例，年齡（28.17±3.73）歲，孕周（37.76±1.07）周；EOSP患者27例，年齡（29.41±5.59）歲，孕周（30.99±1.36）周；LOSP患者28例，年齡（29.00±4.24）歲，孕周（36.53± 1.35）周；另選取無內外科合并癥，因產科和社會因素行剖宮產者的健康孕婦組為對照組29例，年齡（28.72±4.69）歲，孕周（39.31±0.74）周。子癇前期各組患者年齡與健康孕婦組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；子癇前期各組患者孕周與健康孕婦組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。子癇前期診斷標準參照謝幸，茍文麗主編《婦產科學》第8版診斷標準。早發型子癇前期孕周界定為32周。各組孕婦均為單胎妊娠，既往無心臟病、糖尿病、慢性高血壓、肝腎疾病病史。分娩方式均為硬膜外阻滯麻醉下剖宮產分娩。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 所有患者剖宮產術中胎盤娩出后立即取靠近臍帶的母面胎盤組織4×3 cm，用無菌生理鹽水漂洗，去除血液并吸干水份，標本立即置入4%多聚甲醛溶液中固定3天，石蠟包埋備免疫組化用。

1.2.2 檢測方法 采用免疫組化方法。試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組織化學按試劑盒方法嚴格操作。操作步驟：①石蠟包埋連續切片4μm貼附于經多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50min；②石蠟切片經二甲苯脫蠟及100%、95%、90%、80%的梯度酒精脫水；③3%H2O2孵育10min（室溫）封閉滅活內源性過氧化酶；④PBS沖洗5min，把切片放入0.01mol／L（pH6.0）枸櫞酸鹽緩沖液進行微波爐抗原修復10min；⑤加正常山羊血清工作液進行封閉，在37℃濕盒中溫育60min；⑥滴加適當濃度－抗，37℃濕盒中溫育60min后，在濕盒中4℃過夜；⑦PBS洗3×5min，滴加酶標羊抗鼠／兔IgG聚合物即二抗，室溫孵育15min，緊接著PBS洗3 ×5min；⑧DAB顯色：取1ml蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各－滴，室溫顯色；⑨蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染核，封片，觀察。⑩以PBS代替ATl抗體作為陰性對照。

1.2.3 結果判定 在400倍視野下，隨機選取5個視野，結果根據細胞染色強度和陽性細胞數來判斷。根據細胞著色強度計分：細胞內可見大量棕色顆粒為3分，可見較深棕色顆粒為2分，可見淡黃色顆粒為1分，無著色或與背景－致為0分。隨機觀察5個HP，每個視野計數100個細胞，得出陽性細胞百分數計分：≥51%為3分，26%－50%為2分，1%－25%為1分，無陽性細胞為0分。兩種計分方法相加，5－6分為強陽性（＋＋＋），3－4分為陽性（＋＋），2分為弱陽性（＋），0－1分為陰性（－）。

1.2.4 統計學方法 所有數據采用spss19.0統計軟件進行分析處理，組間計數資料采用χ2檢驗和Fisher’s精確概率法，P≤0.05為差異有統計學意義。

表1 各組胎盤組織中Annexin5、ET－1、vWF表達水平

2 結果

2.1 胎盤組織中Annexin 5的定位及表達水平

子癇前期各組與對照組胎盤中Annexin 5的主要表達部位為血管內皮細胞和滋養細胞的胞膜、胞漿，而在間質細胞胞膜、胞漿呈散在表達；子癇前期各組表達呈弱陽性或陰性，表現為胞膜、胞漿染色呈淺棕色或淺黃色，甚至不染色；而在健康對照組表達呈陽性或強陽性，主要表現為胞膜增厚，胞膜、胞漿染色呈棕褐、棕黃或淺黃色。見圖1。子癇前期各組與對照組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。雖表達強度早發型＜晚發型＜輕度組，但各組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 胎盤組織中ET－1的定位及表達水平

子癇前期各組與正常妊娠組胎盤ET－1在血管內皮細胞、滋養細胞及絨毛間質均有表達。子癇前期各組胎盤ET－1與正常妊娠組比較，在胎盤中的表達部位－致，但子癇前期各組表達程度明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。而子癇前期患者各組間隨病情的加重ET－1水平呈上升趨勢，早發型重度子癇前期患者ET－1水平高于晚發型重度子癇前期患者，而晚發型重度子癇前期患者ET－1水平明顯高于輕度子癇前期患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 胎盤組織中vWF的定位及表達水平

子癇前期各組與正常妊娠組胎盤vWF在滋養細胞及間質中均有陽性表達，主要集中在細胞膜和細胞漿中，少量表達于絨毛間質中。子癇前期各組與對照組比較，胎盤組織vWF的表達明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。重度組（早發型與晚發型）子癇前期胎盤組織vWF的表達顯著高于輕度子癇前期組，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；而早發型重度子癇前期組與晚發型重度子癇前期組比較，早發型胎盤組織vWF的表達雖有增高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

圖1 Annexin5在各組胎盤中的表達（SP×400）

圖2 ET－1在各組胎盤組織中的表達（SP×400）

圖3 vWF在各組胎盤組織中的表達（SP×400）

3 討論

3.1 Annexin 5與子癇前期

Annexin 5是研究最早、在人體內分布最廣的膜聯蛋白之－，廣泛存在于機體的各種組織細胞中，位于人類4號染色體q26－q28，含28kbDNA，具有廣泛和重要的生物學功能，其中抗凝作用是其重要功能。在胎盤中Annexin 5存在于合體滋養細胞層的頂端，是－種抗凝蛋白，正常孕婦中在對暴露于活化血小板表面的磷脂酰絲氨酸具有高親和性而達到抗凝作用。在子癇前期患者中Annexin 5表達下降導致抗凝－纖溶系統失衡而出現高凝狀態，引起胎盤子宮螺旋小動脈形成微血栓導致胎盤組織缺血缺氧，從而引發子癇前期、胎盤供血不足、胎兒宮內生長遲緩［2］。近來研究發現，annexin 5基因上的M2基因型亦是－個與子癇前期的風險因子。研究發現［2］AnnexinV基因中M2突變會降低Annexin 5基因啟動子的啟動活性，導致Annexin 5表達減少。S.Ota［3］等研究胎兒Annexin 5基因顯示突變M2基因型是減少Annexin 5的啟動基因，突變M2基因型無論來自父方還是來自母方，都是發生子癇前期的基本的決定因素。攜帶M2基因的婦女發生妊娠期高血壓疾病的幾率是未攜帶者的兩倍，進－步說明Annexin 5表達不足很可能是造成子癇前期發生的原因之一。Fang Shu［4］等用免疫組化方法檢測胎盤Annexin 5水平，表明子癇前期患者胎盤Annexin 5表達下降可能導致胎盤絨毛間高凝狀態，從而導致胎兒生長受限。Xin H［5］等研究表明子癇前期各組較對照組胎盤中AnnexinV表達水平下降，但子癇前期各組間表達未見明顯差異，這些與本研究相符。

3.2 ET－1與子癇前期

子癇前期發病與子宮螺旋小動脈痙攣減少供給及胎盤灌流不足有關。而ET－1ET1是血管內皮細胞產生的強大的縮血管物質，是目前發現的最強的內源性縮血管肽，通常情況下，血管內皮細胞合成少量的ET－1，通過自分泌或旁分泌作用于血管平滑肌細胞，引起血管收縮［6］。通過ETA、ETB受體對子宮螺旋動脈和胎盤血管進行調節［7］。正常孕婦血漿中ET－1的濃度約為5－10pg／ml，不足以收縮血管，而在子癇前期孕婦血漿ET－1的濃度為20－50pg／ml，促進螺旋小動脈痙攣，導致子癇前期發生，同時胎盤組織缺血、缺氧出現胎兒宮內生長受限［8］。Zhao XL［9］等研究表明ET－1在子癇前期患者血漿、臍血及胎盤中均高表達。本研究顯示子癇前期患者各組間隨病情的加重ET－1水平呈上升趨勢，且早發型高于晚發型。差異均有統計學意義。

3.3 vWF與子癇前期

血管性假血友病因子（vonWillebrandfactor vWF）是反映血管內皮細胞損傷敏感性指標，vwF是外源性凝血系統啟動的因子［10］。vWF來源于內皮細胞，且又貯存于內皮細胞之中，當內皮受損時，vWF釋放入血，血漿中的vWF的量就增加，分泌到血漿或血管內皮下的vWF作為分子橋配體參與血小板黏附、聚集，并直接參與血栓形成。己經證實，正常孕婦血漿中vWF含量較非孕婦女升高，雖著妊娠周數增加有逐漸增加趨勢，這屬于保護性生理機制，有利于胎盤剝離后的止血。而在子癇前期患者中處于異常高表達，現國外研究也表明，妊娠期高血壓疾病患者臨床表現剛－出現，就已測得其血漿中vWF水平升高，最早可在孕24周時測出［11］。Mauro Parra－Cordero等［12］研究表明子癇前期患者血漿中vWF水平明顯升高，這種升高是因為胎盤缺血缺氧導致胎盤合體滋養細胞凋亡增加從而導致內皮細胞損傷vWF釋放入血漿內增加。胎盤免疫組化顯示vWF在胎盤合體滋養細胞表達減少，但在絨毛間隙表達增多。本研究顯示，子癇前期患者中vWF表達明顯高于健康孕婦組，且病情越重，vWF表達水平越高。

綜上所述，子癇前期患者體內免疫系統及凝血－纖溶系統失衡，子宮胎盤床螺旋小動脈形成障礙以及胎盤滋養細胞植入子宮內膜過淺，導致胎盤組織缺血、缺氧，通過生成多種細胞因子及炎癥介質，使其進入孕婦母體血液循環引起廣泛的血管內皮細胞損傷，使ET1、vWF等縮血管因子的合成和釋放增加，導致血管內皮功能失衡，從而引起全身小動脈痙攣及胎盤灌流不足，導致子癇前期的發生。通過研究胎盤中Annexin 5、ET－1、vWF的表達，探究子癇前期發病機制，旨對子癇前期的早期診斷及治療有－定臨床價值。

［1］謝 幸，茍文麗.婦產科學［M］.第8版.北京：人民衛生出版社，2013：65－66.

［2］Tiscia G，colaizzo D，chinni E，et a1.Haplotype M2in the annexin A5（ANxA5）gene and the occurrence of obstetric complications［J］.Mb Haemost，2009，102（2）：309.

［3］S.Ota，H.Miyamura，，H.Nishizawa et al.Contribution of fetal ANXA5gene promoter polymorphisms to theonset of pre－eclampsia［J］.Placenta，2013，34（12）：1202.

［4］Fang S，Sugimura M，Kanayama N，et al.lmmunohistochemical study of Annexin V expression in placentae of preeclampsia［J］.Gynecol Obstet Invest，2000，49：17.

［5］Xin H，Wang HL.Expression changes and clinical significance of annexin V in maternal blood and placenta in patients with preeclampsia［J］.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2011，46（2）：88.

［6］Bohm F，Pernow J.The importance of endothelin－l for vascular dysfunction in cardiovascular disease［J］.Cardiovase Res，2007，76（1）：8.

［7］Clotilde Dechanet，Aurelie Fort，Elisabet Barbero－Camps，et al.Endothelin－Dependent Vasoconstriction in Human Uterine Artery：Application to Preeclampsia［J］.PLoS ONE，2011，1（6）：e16540.

［8］G Fiore，P Florio，L Micheli，et al.Endothelin－1triggers placental oxidative stress pathways：putative role in preeclampsia［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90，4205.

［9］Zhao XL，Liu Z，Liu C.Expression and significance of AT1－AA and ET1in materal peripheral blood，umbilical cord blood and placenta in preeclampsia［J］.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2012，47（10）：721.

［10］On1shi H，Koniy UK，Twashita M，et al.Fibrin monomer－complex in normal pregnant women：apotential thrombotie marker in Pregnancy［J］.Ann CIin Biochern，2007，44（4）：449.

［11］Ma gorzata，Kobusiak.Impact of nebivolol on levels of serum nitric oxide，plasma Von Willebrand factor and exercise stress testing Parameters in hypertensive and ischemic heart disease Patients［J］.Cardiology Joumal，2008，15（2）：162.

［12］Mauro Parra－Cordero，Cleofina Bosco，Jaime Gonzalez，et al.Immunohistochemical expression of von Willebrand factor in the preeclamptic placent［J］.J Mol Hist，2011（42）：459.

Expression of Annexin5，Endothelin－1，von Willebrand factor in Placenta with Preeclampsia

REN Chun－li，TANG Xinguo，REN Lei.
（Department of Obstetrics，the Affiliated Hospital of Chengde Medical University，Chengde Hebei 067000，China）

Objective To investigate the expression of Annexin 5，Endothelin－1and von Willebrand factor in the placenta，and to explore the mechanism of preeclampsia.Methods Expression of Annexin 5，Endothelin－1and von Willebrand factor was detected by immunohistochemistry in the placenta of 84women with preeclampsia including 29cases of mild preeclampsia，27cases of early－onset severe preeclampsia，28cases of late－onset severe preeclampsia and control group（29cases），respectively.Results ①The expression of annexin 5in the placenta decreased significant with preeclampsia compare to control group（P＜0.05）.Although，early－onset severe group lower late－onset severe group lower mild preclampsia，without significant difference（P＞0.05）.②The expression of endothelin－1in the placenta increased significant with preeclampsia compare to control group（P＜0.05）.With the patient＇s condition aggravating，the expression of endothelin－1increasing，early－onset severe group higher late－onset severe group higher mild preclampsia，with significant difference（P＜0.05）.③The expression of von Willebrand factor in the placenta increased significant with preeclampsia compare to control group（P＜0.05）.Severe preeclampsia including early－onset severe group and late－onset group were higher significant than mild preeclampsia（P＜0.01，P＜0.05）.Although，early－onset severe group higher late－onset severe group，without significant difference（P＞0.05）.Conclusion Annexin 5，Endothelin－1and von Willebrand factor in the placenta may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia by affecting coagulation and blood vessel endothelium system.

Preeclampsia；Annexin 5；Endothelin－1；von Willebrand factor；immunohistochemistry

R714.24＋4

A

2013－06－20）

1007－4287（2014）07－1141－04