整合素連接激酶對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用

周劍云，孫煒，張新，王建軍，曹澤

·基礎(chǔ)研究·

整合素連接激酶對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用

周劍云，孫煒，張新，王建軍，曹澤

目的研究整合素連接激酶(ILK)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的影響。方法分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用表達(dá)對(duì)照綠色熒光蛋白(GFP)和GFP融合野生型ILK、突變型ILK的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，用含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、B27的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖速度及向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的效率。結(jié)果轉(zhuǎn)染ILK的間充質(zhì)干細(xì)胞中，ILK穩(wěn)定表達(dá)，增殖速度加快，神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的效率提高；野生型ILK優(yōu)于突變型ILK。結(jié)論ILK促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化。其作用機(jī)制與激酶活性有關(guān)。

整合素連接激酶；間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞

[本文著錄格式]周劍云，孫煒，張新，等.整合素連接激酶對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(11):1022-1027.

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種具有自我更新能力和多種分化潛能的前體細(xì)胞，不僅能分化成內(nèi)、外胚層細(xì)胞，也能夠分化成中胚層的多種衍生細(xì)胞系[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性病變的修復(fù)與再生一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)，MSCs應(yīng)用于臨床治療神經(jīng)退行性疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是一種較好的策略，因?yàn)槟殠?lái)源的MSCs容易收集，且細(xì)胞數(shù)量較多[2-6]。

體外培養(yǎng)的MSCs根據(jù)培養(yǎng)液及添加的誘導(dǎo)因子不同，分化成不同種類(lèi)的前體細(xì)胞及成熟細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)在人臍帶MSCs向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞骨架重新排列，整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)表達(dá)上調(diào)[7]。推測(cè)MSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中ILK被激活，在貼壁依賴(lài)的MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，對(duì)人臍帶MSCs轉(zhuǎn)染ILK，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞是否更容易向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(改良培養(yǎng)基)：HYCLONE公司。胎牛血清、小鼠抗GAPDH單克隆抗體：SIGMA公司。蛋白酶抑制劑、ECL Western顯色試劑、小鼠抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)單克隆抗體：ROCHE公司。硝酸纖維素膜：PALL公司。Lipofectamine 2000：INVITROGEN公司。羊抗兔二抗、高保真DNA聚合酶Pfx、pEGFP-C2質(zhì)粒載體、EcoRI內(nèi)切酶、XhoI內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、HEK 293細(xì)胞株、U2OS細(xì)胞株、Top10感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒抽提試劑盒：OMEGA公司。B27添加劑：Invitrogen公司。5×SYBR Green PCR Master Mix：AB Applied Biosystems公司。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast grow factor-basic,bFGF)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、兔抗巢蛋白多克隆抗體(nestin)、兔抗多克隆CD133、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、G418：MERCK公司。胰蛋白酶：GIBCO公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：德國(guó)KENTRO公司。DK-8D電熱恒溫水槽、LE-80K型低溫超速離心機(jī)、JTT-1300型超凈工作臺(tái)、CK30倒置熒光顯微鏡：OLYMPUS公司。Power PAC 300電泳儀、Trans blot SD轉(zhuǎn)膜儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。紫外可見(jiàn)分光光度：日本HITACHI公司。

1.2 ILK基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank ILK基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物L(fēng)IK-F和LIK-R(見(jiàn)表1)，根據(jù)載體質(zhì)粒要求在引物中引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，采用高保真DNA聚合酶Pfx，以HEK 293 cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ILK基因片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將該目的片段用EcoRI和XhoI消化；利用T4 DNA連接酶將含黏端的目的片段與酶切處理過(guò)的pEGFP-C2載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，利用酶切鑒定pEGFP-C2-ILK構(gòu)建，命名為pEGFP-ILKWT。

利用PCR誘導(dǎo)點(diǎn)突變的方法，設(shè)計(jì)引物ILK-mut-F和ILK-mut-R(見(jiàn)表1)，結(jié)合引物L(fēng)IK-F和LIK-R，獲得突變ILK-mutant目的片段。方法如下。用pEGFP-C2-ILK做模板，先分別用引物組ILK-F/ ILK-mut-R和ILK-mut-F/ILK-R進(jìn)行擴(kuò)增，分別回收擴(kuò)增產(chǎn)物；然后取兩種產(chǎn)物各10 ng混合，用引物ILK-F和ILK-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到突變ILK-mutant。用EcoRI和XhoI酶切ILK-mutant和pEGFP-C2，回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，利用酶切鑒定pEGFP-C2-ILKmutant構(gòu)建，命名為pEGFP-ILKMT。突變將ILK第362位Glu突變?yōu)長(zhǎng)ys。

1.3 U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染及測(cè)定

分別由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKWT、pEGFP-ILKMT及pEGFP-C2質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前24 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，在培養(yǎng)基500 μl中接種1.0×105細(xì)胞，待貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞融合達(dá)70%～80%開(kāi)始轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前4 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。

將質(zhì)粒1 μg與Lipofectamine 2000脂質(zhì)體6 μl分別稀釋于無(wú)血清DMEM 100 μl，室溫放置5 min，然后將兩者混合，室溫放置15 min。加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h。

細(xì)胞4%多聚甲醛固定，DAPI染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

取上述轉(zhuǎn)染收獲細(xì)胞，RAPI裂解液裂解，取蛋白20 μg行SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，分別用GFP抗體、GAPDH抗體檢測(cè)目的條帶。

1.4 MSCs轉(zhuǎn)染及測(cè)定

臍帶取自北京大學(xué)人民醫(yī)院足月新生兒剖宮產(chǎn)臍帶，均經(jīng)父母授權(quán)同意。MSCs分離和培養(yǎng)方法見(jiàn)前期研究[8]。

新鮮分離的原代MSCs培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度接近80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天用胰酶消化MSCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml，每孔2 ml接種6孔板。5%CO237℃培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右。取pEGFP-ILKWT、pEGFP-ILKMT各4 μg加入DMEM培養(yǎng)基100 ml中制成A液和B液；取兩管Lipofetamine 2000各6 ml加入DMEM培養(yǎng)基100 ml中制成C液。均室溫靜置5 min。將A液和B液分別與C液混勻，室溫靜置20 min后，分別滴加于上述6孔板中，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，混和均勻。5%CO237℃培養(yǎng)48 h后篩選。

經(jīng)G418對(duì)MSCs最小致死量測(cè)定，得到最小致死量600 μg/ml。將上述培養(yǎng)48 h后的MSCs經(jīng)600 μg/ ml G418壓力篩選15 d后獲得單個(gè)細(xì)胞克隆。挑取單個(gè)細(xì)胞克隆，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)獲得抗性細(xì)胞。抗性細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及形態(tài)與正常MSCs無(wú)差異。

轉(zhuǎn)染48 h后，MSCs轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿。用含bFGF、EGF、B27的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)，且每2天更換培養(yǎng)基。共培養(yǎng)15 d。

將GAPDH、CD133及Nestin定量模板分別進(jìn)行10倍梯度稀釋得到101-1010濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板，同時(shí)進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系加入毛細(xì)管后使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。將檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle,Ct)值處，將不同濃度模板的對(duì)數(shù)和相應(yīng)Ct值作圖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳及熔解曲線分析。每一標(biāo)本以所測(cè)的CD133及Nestin拷貝數(shù)和GAPDH拷貝數(shù)的比值代表CD133及Nestin mRNA表達(dá)水平。為進(jìn)一步確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性，將GAPDH、CD133及Nestin擴(kuò)增產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

提取總蛋白，取80 μg總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，滴加一抗(1∶l000)，4℃過(guò)夜，PBS洗膜10 min，共4次；滴加二抗(1∶1000)，37℃孵育2 h，PBS洗膜10 min，共4次。按ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色，凝膠成像儀采集圖像。Quantity-one 4.31軟件分析CD133及Nestin灰度值與GAPDH灰度值的比值代表CD133及Nestin蛋白表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞增殖測(cè)定

取對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞，常規(guī)消化傳代，制成細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分分散，單個(gè)細(xì)胞百分率95%以上。細(xì)胞記數(shù)，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。將細(xì)胞懸液倍比稀釋。按照每皿100個(gè)細(xì)胞分別接種5 ml細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿(直徑60 mm)中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)皿置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2～3周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。PBS液浸洗2次，空氣干燥。甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥。Giemsa染液染色10 min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。數(shù)碼相機(jī)拍照，計(jì)數(shù)肉眼可見(jiàn)的克隆數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 GFP-ILK在U2OS細(xì)胞表達(dá)和定位

U2OS細(xì)胞表達(dá)GFP-ILKWT、GFP-ILKMT融合蛋白(79 kDa)。見(jiàn)圖1。

熒光顯微鏡觀察，GFP-ILKWT與GFP-ILKMT均定位于細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)在細(xì)胞膜上有少量分布，兩者定位無(wú)明顯差異(圖2)。

2.2 MSCs向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化

MSCs在培養(yǎng)24 h內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞聚集成堆，細(xì)胞逐漸回縮，最后形成懸浮細(xì)胞球，并可不斷增殖擴(kuò)大，約10 d后出現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞球懸浮生長(zhǎng)。將細(xì)胞球機(jī)械吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，單個(gè)細(xì)胞能繼續(xù)懸浮生長(zhǎng)，并逐漸擴(kuò)增形成小的細(xì)胞球，小的細(xì)胞球直徑逐漸增大。培養(yǎng)15 d后轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKWT的MSC比轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKMT的MSC產(chǎn)生更多的神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞(圖3)。

轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKWT、pEGFP-ILKMT的MSC，培養(yǎng)后qPCR檢測(cè)Nestin和CD133基因比轉(zhuǎn)染pEGFP-C2高4～8倍(圖4)。將具有GFP熒光信號(hào)的細(xì)胞挑選出來(lái)，Western blotting檢測(cè)顯示，Nestin和CD133表達(dá)由高到低依次為轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKWT、轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKMT和轉(zhuǎn)染pEGFP-C2(圖5)。

2.3 細(xì)胞增殖

U2OS細(xì)胞克隆形成數(shù)高到低依次為轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKWT、轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKMT和轉(zhuǎn)染pEGFP-C2(圖6)。

圖1 U2OS細(xì)胞表達(dá)GFP-ILKWT、GFP-ILKMT

圖3 不同轉(zhuǎn)染的MSCs神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞比例

圖2 U2OS細(xì)胞表達(dá)GFP-ILKWT、GFP-ILKMT(熒光顯微鏡，10×100)

圖4 qPCR測(cè)定Nestin和CD133表達(dá)

圖5 Western blotting測(cè)定Nestin和CD133表達(dá)

圖6 U2OS細(xì)胞克隆形成

3 討論

ILK是一個(gè)分子量59 kDa、具有Ser/Thr蛋白激酶活性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白分子。1996年，Hannigan等在研究整合素β1結(jié)合蛋白的過(guò)程中，利用酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)了ILK[9]。ILK具有調(diào)整細(xì)胞骨架蛋白重組、細(xì)胞增殖、有絲分裂、侵襲的作用，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞生理機(jī)能至關(guān)重要[10]。研究顯示，ILK在諸多腫瘤中表達(dá)水平及活性增強(qiáng)[11]。

神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生起著重要作用，其中ILK在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞起著重要作用[12]。神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞是具有類(lèi)似于神經(jīng)干細(xì)胞樣生長(zhǎng)、增殖、向神經(jīng)細(xì)胞分化特征的一類(lèi)細(xì)胞，有望像神經(jīng)干細(xì)胞一樣在神經(jīng)修復(fù)和再生方面起一定作用。目前ILK在神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化中的機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在MSCs中高表達(dá)ILKWT和 ILKMT，然后將細(xì)胞在添加bFGF、EGF和B27三種因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs高表達(dá)ILK后，向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的數(shù)目明顯提高，神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分子標(biāo)志物Nestin和CD133的表達(dá)量明顯增多。

對(duì)ILK的激酶活性突變體ILKMT的研究發(fā)現(xiàn)，MSC經(jīng)過(guò)pEGFP-ILKWT、pEGFP-ILKMT轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)15 d后，轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKWT的MSC比轉(zhuǎn)染pEGFP-ILKMT的MSC更多分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞。表明ILK促進(jìn)MSC的分化依賴(lài)于其激酶活性。克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，ILK促進(jìn)細(xì)胞增殖也同樣依賴(lài)于其激酶活性。然而，Porcheri等研究發(fā)現(xiàn)，敲除ILK基因增加了成年鼠腦中神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖[13]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，ILK在細(xì)胞增殖方面有時(shí)表現(xiàn)不同，甚至有相反的作用，可能與細(xì)胞所處的環(huán)境或分化的階段有關(guān)[14]。具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

Porcheri等利用病毒基因重組技術(shù)，使RSU-1 (Ras suppressor unit-1)表達(dá)缺失，增強(qiáng)了ILK下游信號(hào)分子PINCH1/2依賴(lài)性JNK(c-Jun N-terminal protein kinase)的活性，引起一系列反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖[13]。Duxbury等的研究證實(shí)，ILK能磷酸化Akt的Ser473位點(diǎn)，這種磷酸化修飾對(duì)于Akt的完全激活是必須的；活化的Akt使糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK)磷酸化，從而調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞增殖[15]。Naves等研究證實(shí)，ILK與Wnt信號(hào)通路相互作用，通過(guò)影響Wnt通路下游的P-cadherin和Akt，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附喪失，以及細(xì)胞同細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用減弱，促進(jìn)形成局灶性腎小球硬化[16]。

MSC中高表達(dá)ILK之后導(dǎo)致更多神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)的原因，可能涉及上述某一途徑。有待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Integrin-linked Kinase on Derivation of Neural Stem-like Cells from Mesenchymal Stem Cells

ZHOU Jian-yun,SUN Wei, ZHANG Xin,WANG Jian-jun,CAO Ze.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Department of Surgery,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Centre,Beijing 100068,China

ObjectiveTo investigate the effect of integrin-linked kinase(ILK)on inducing mesenchymal stem cells(MSCs)to neuron stem-like cell in vitro.MethodsMSCs isolated from umbilical cord were transfected with plasmid DNA encoding green fluorescent protein (GFP)and GFP-fusion ILK,wild and mutant,respectively;and cultured in serum-free media with basic fibroblast growth factor,epidermal growth factor and B27.It was assessed with the proliferative activity and the efficiency of differentiation into neural stem-like cell.ResultsMSCs transfected with GFP-fusion wild ILK expressed ILK and kinase-dead mutant ILK stably.The activity of proliferation increased and more of them differentiated into neural stem-like cell,which express CD133and Nestin validated by PCR and Western blotting,and more of wild than of mutant.ConclusionIntegrin-linked kinase may play a positive role in MSC differentiation into neural stem-like cell,which may associate with the activity of kinase.

integrin-linked kinase;mesenchymal stem cells;proliferation;neural stem cell-like cell

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.11.007

R318.5

A

1006-9771(2014)11-1022-06

2013-08-15

2014-09-03)

中國(guó)康復(fù)研究中心基金項(xiàng)目(No.2011-31)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院外科，北京市100068。作者簡(jiǎn)介：周劍云(1970-)，男，北京市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：顱腦外傷、腦血管病、神經(jīng)康復(fù)醫(yī)學(xué)。