遠志皂苷元對新生大鼠海馬神經干細胞分化的影響

陳玉靜，黃小波，陳文強，王寧群

遠志皂苷元對新生大鼠海馬神經干細胞分化的影響

陳玉靜，黃小波，陳文強，王寧群

目的觀察遠志皂苷元對體外培養的胎鼠海馬神經干細胞(NSCs)增殖分化的影響。方法利用無血清DMEM/F12體外培養技術從新生Wistar大鼠大腦海馬中培養NSCs，添加不同濃度(0、1、2、4 μg/ml)遠志皂苷元。應用免疫熒光技術對NSCs及其分化后的細胞進行鑒定。結果培養的NSCs能夠表達Nestin，并具有分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的能力。在同一接種密度條件下，遠志皂苷元干預組的Nestin陽性細胞數較對照組減少(P＜0.05)，神經元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細胞數較對照組增加(P＜0.05)。結論遠志皂苷元能促進新生大鼠大腦海馬NSCs的分化。

遠志皂苷元；神經干細胞；細胞培養；細胞分化；大鼠

[本文著錄格式]陳玉靜，黃小波，陳文強，等.遠志皂苷元對新生大鼠海馬神經干細胞分化的影響[J].中國康復理論與實踐, 2014,20(11):1028-1030.

在哺乳動物中樞神經系統存在神經干細胞(neural stem cells,NSCs)，主要分布在海馬、紋狀體、腦室下區、嗅球以及發育過程中的大腦皮質和脊髓[1]。NSCs是一類具有多向分化和自我更新能力的細胞[2-3]，位于海馬部位的NSCs經增殖分化產生的神經發生與學習記憶密切相關[4]。本實驗從新生大鼠大腦海馬中分離、培養成細胞懸浮球，經鑒定呈Nestin陽性，表明為NSCs。觀察中藥提取物遠志皂苷元對其增殖分化的影響，以研究遠志皂苷元的神經元保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新生Wistar大鼠：中國醫學科學院實驗動物中心提供。

鼠抗Nestin、鼠抗神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、兔抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體：SIGMA公司。免疫熒光二抗FITC羊抗兔、抗鼠IgG以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)試劑：CHEMICON公司；神經干細胞基礎培養液(DMEM/F12加B27)、添加20 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和20 ng/ ml表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)：GIBCO公司。遠志皂苷元：中國藥品生物制品檢定所。

1.2方法

1.2.1 原代培養

新生當天Wistar大鼠，乙醇消毒后斷頭取腦，取雙側大腦皮質置D-Hanks液中；剝離腦膜及血管，用眼科剪剪碎成糊狀，加DMEM/F12培養液(Hyclone)；細口吸管機械吹打，200目金屬濾網過濾，獲得單細胞懸液并計數。以5×105/ml細胞濃度接種到培養瓶中，加入2%B27、終濃度20 ng/ml EGF和bFGF，置5%CO2恒溫孵箱中37℃培養。3～4 d半量補液。培養7～9 d后，機械分離神經球進行傳代。

1.2.2 傳代培養

將原代培養7～9 d形成的神經球(50～200細胞/球)懸液移至離心管，1200 r/min離心5 min，共3次，吸棄上清液。機械吹打制成單細胞懸液，以5×105/ml細胞濃度接種培養。6～8 d傳代1次。

1.2.3 神經干細胞的分化及遠志皂苷元的誘導作用

收集培養的第2代神經球，以2×105/ml細胞濃度接種于24孔培養板各孔中。孔底放置預先用100 mg/L多聚賴氨酸處理過的蓋玻片。每板分對照組，遠志皂苷元低(1 μg/ml)、中(2 μg/ml)和高(4 μg/ml)劑量組，每組6孔。對照組培養液為原培養液去除bFGF及EGF，另加10%胎牛血清(FBS)配制。遠志皂苷元組培養液在對照組培養液的基礎上加入不同劑量遠志皂苷元。培養板置飽和濕度、37℃、5%CO2孵箱中培養。

1.2.4 細胞鑒定

增殖期測定NSC標志物Nestin。各組分化培養7 d時，測定Nestin以及神經細胞標志物NSE和星形膠質細胞標志物GFAP。

取出各孔蓋玻片，4%多聚甲醛固定，PBST漂洗5 min，共3次。用含0.3%Triton X-100的PBST破膜30 min，山羊血清37℃封閉30 min；一抗分別為單克隆鼠抗Nestin(1∶100)、鼠抗NSE(1∶500)和多克隆兔抗GFAP(1∶50)；滴加相應的FITC標記的熒光二抗(1∶500)，37℃避光孵育1 h；PBST漂洗5 min，共3次。使用50 μg/ml DAPI復染核，室溫孵育20 min；PBST漂洗5 min，共3次。Olympus倒置相差熒光顯微鏡及普通光學顯微鏡下觀察并拍照。采用Kodak圖像分析系統及Image-Proplus軟件測量突起長度。

圖1 神經球(第8天，400×)

1.3 統計學分析

使用SPSS 11.0統計軟件進行分析。實驗數據采用(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 NSCs生長狀態

培養第1天細胞呈圓形亮點；第2～3天可見有數個細胞形成的啞鈴樣結構；第4～5天可見幾十個細胞形成的神經球(neurosphere)；第6天可見神經球明顯增大，直徑100～150 μm；第8～10天，大的神經球直徑已達到150～200 μm(圖1)。原代及多次傳代培養形成克隆球的細胞圓潤飽滿，界清晰，活力狀態佳。Nestin表達陽性(圖2)。

2.2 細胞分化

在去除bFGF及EGF，加10%胎牛血清的培養基培養7 d后，NSCs部分分化為NSE陽性的神經元(圖3)和GFAP陽性的星形膠質細胞(圖4)。NSE陽性神經元的胞體呈圓形，有較長軸突。GFAP陽性星形膠質細胞的胞體稍小，胞突長而直，分支較少。

添加遠志皂苷元培養7 d后，Nestin陽性細胞數較對照組減少(P＜0.05)，NSE和GFAP陽性細胞數較對照組增多(P＜0.05)。隨遠志皂苷元濃度增加，NSE陽性細胞數逐漸增多(P＜0.05)，GFAP陽性細胞數無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組細胞分化情況(CD)

圖2 Nestin染色(400×)

圖3 NSE染色(400×)

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經退行性疾病，其特征性病理變化為淀粉樣蛋白沉積、神經元纖維纏結、基底前腦和海馬區的神經元減少。AD中醫辨證多屬“腎精虧損，髓海空虛”。《黃帝內經》中提出“腎生髓”理論，現代研究證實，“腎生髓”理論與AD明顯相關[5]，臨床上治療AD多從補腎論治。補腎填髓中藥能促進神經元代謝，激活內源性神經營養因子，促進神經元存活與再生。

AD腦的神經再生過程受到嚴重損害，這可能是導致認知功能進行性減退的重要病理機制之一。成年海馬的神經發生與空間認知功能有關[6-7]；如能促進成年神經發生可以增強空間記憶功能，而抑制神經發生可出現空間記憶功能的下降[8]。

1992年，Reynolds等首先從成年鼠紋狀體中分離出NSCs。NSCs是一類較原始的神經細胞，存在于胚胎和成年哺乳動物中樞神經系統的廣泛區域，具有自我更新和增殖的能力，可表達特殊標志蛋白Nestin[9]。NSCs具有分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞的能力。探索NSCs的定向分化已經成為備受關注的焦點。

研究表明，中藥不僅可以保護神經細胞，提高神經元抵抗損傷的能力，而且能促進NSCs的增殖，并誘導其定向分化為功能性神經元。

中藥遠志具有寧心安神、祛痰開竅的作用，近年來在抗衰老、益智、抗氧化等方面的研究較多[10]，能夠抗氧化、清除自由基[11-12]。

遠志皂苷元是遠志的主要活性成分之一。研究發現，遠志皂苷元可以通過抑制氧化應激反應，改善AD模型小鼠的學習記憶能力[13]。本課題組前期研究發現，遠志皂苷元能夠抑制tau蛋白磷酸化，能夠對抗甲基乙二醛引起的細胞毒性，具有保護海馬神經元的作用[14-16]。

圖4 GFAP染色(400×)

本研究結果提示，遠志皂苷元可促進NSCs向神經元方向分化。綜合以前的研究結果，遠志皂苷元對神經元的保護作用機制可能是多方面的。促進海馬中NSCs向神經元分化的神經再生機制可能是其中之一。

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Effect of Tenuigenin on Differentiation of Neural Stem Cells from Hippocampus of Newborn Rats

CHEN Yu-jing,HUANG Xiao-bo, CHEN Wen-qiang,WANG Ning-qun.Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo observe the effect of tenuigenin on differentiation of hippocampal neural stem cells(NSCs).MethodsNSCs isolated from newborn(within 24 h)Wistar rats hippocampus were cultivated in vitro with serum free and clone culturing technology.Tenuigenin of different doses(0,1,2,4 μg/ml)were added in the medium,and the proliferation and differentiation of the cells were identified with immunofluorescence staining.ResultsThe neural spheres obtained from the hippocampi of newborn rats were positive for Nestin expression,with the potential for further cloning and differentiation into neurons or glial cells.The incidence of neuron specific enolase and glial fibrillary acidic protein positive cells increased in all the tenuigenin groups compared to the control(P＜0.05),while the Nestin positive cells decreased(P＜0.05).ConclusionTenuigenin may promote the differentiation of neural stem cell into nerve cell.

tenuigenin;neural stem cells;cell culturing;cell differentiation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.11.008

R742

A

1006-9771(2014)11-1028-03

2014-01-13

2014-02-08)

國家自然科學基金項目(No.81102624)。

首都醫科大學宣武醫院中醫科，北京市100053。作者簡介：陳玉靜(1979-)，女，漢族，吉林吉林市人，博士，主治醫師，主要研究方向：腦病的中醫藥防治研究。