齊墩果酸、丹酚酸對UUO大鼠腎及腎小管功能的影響*

張 翼 李 麗 何立群

（1.上海市長寧區中心醫院，上海 200336；2.上海市曙光醫院，上海 200336）

齊墩果酸、丹酚酸對UUO大鼠腎及腎小管功能的影響*

張 翼1李 麗1何立群2△

（1.上海市長寧區中心醫院，上海 200336；2.上海市曙光醫院，上海 200336）

目的觀察抗行靈方的主要藥用成分齊墩果酸和丹酚酸在單側輸尿管梗阻（UUO）模型大鼠腎間質纖維化（RIF）過程中的作用及機制。方法健康雄性SPF級SD大鼠48只，隨機分為4組，其中假手術組、UUP模型組、齊墩果酸組、丹酚酸組各12只。造模后第28日腹主動脈采血檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN），收集24 h尿液，檢測24 h尿蛋白定量、取腎組織，HE染色比較各組腎小管間質損傷程度。結果 在UUO模型中，丹酚酸和齊墩果酸在延緩實驗大鼠腎功能衰竭中的功能和側重各有不同，除假手術外各組大鼠腎功能出現失代償，尿微量蛋白排泄增多，腎間質纖維化加重；與假手術組、模型組相比，齊墩果酸組SCr、NAG、24 h尿蛋白定量的水平顯著降低；丹芬酸組BUN、NAG、α1-M、24 h尿蛋白定量的水平顯著降低 （P＜0.05或P＜ 0.01）。結論丹酚酸及齊墩果酸單體均能夠保護腎功能，降低血肌酐和尿素氮，并在一定程度上減少尿微量蛋白的排泄。

齊墩果酸 丹酚酸 單側輸尿管梗阻模型 腎功能 腎小管功能 腎間質纖維化 抗纖靈方丹參 川牛膝

慢性腎臟疾病（CKD）已經成為全球性公共健康問題，呈現高發病率、低知曉率的特點［1］。終末期腎病（ESRD）是各種CKD進展的最終結局，其發病率逐年增長，且治療費用昂貴。單側輸尿管梗阻（UUO）模型是目前較為成熟的一種研究腎間質纖維化的實驗動物模型［2］。并且嚙齒類動物的纖維化特征與人類相似［3］。抗纖靈方是本文通信作者何立群教授的經驗方，其治療慢性腎功能衰竭效果良好［4-6］。本實驗應用UUO大鼠模型，觀察其主要藥用成分齊墩果酸、丹酚酸單體在改善UUO大鼠腎功能及腎小管功能上的作用及機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠48只，體質量（180±20）g，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號SYXK（滬）2004-0005；實驗動物合格證號0058668。由上海中醫藥大學實驗動物中心飼養，12 h光照，相對濕度45％，自由飲水飲食。適應性喂養1周。

1.2 藥物及試劑 丹酚酸（批號110420），齊墩果酸（批號110531），均購自上海融禾醫藥科技有限公司，予4℃冰箱保存。24 h尿蛋白定量 （批號E-30705），α1-MG（批號E-30124），β2-MG（批號E-30066），TRF（批號E-30682），NAG（批號E-30484）試劑盒均購自上海科醫聯創生物科技有限公司。

1.3 分組與造模 48只大鼠隨機分為4組，分為假手術組、模型組、丹酚酸組和齊墩果酸組，每組12只。造模方法：3％戊巴比妥鈉（1.5 mL/Kg）腹腔注射麻醉后，右側臥位于手術臺上，局部剃毛，以碘伏常規消毒，取左側左肋脊角處附近為手術切口，逐層分離，暴露左側腎臟，分離左側輸尿管，在輸尿管中段兩端各用絲線結扎，不剪斷輸尿管，然后縫合。假手術組除不結扎輸尿管外，余手術步驟相同。

1.4 給藥方法 假手術組、模型組予生理鹽水5 mL/（kg·d）灌胃。丹酚酸組及齊墩果酸組給藥濃度為2 mg/mL，丹酚酸組按10 mg/（kg·d）的劑量灌胃，齊墩果酸組按6 mg/（kg·d）的劑量灌胃，每毫升含單藥有效成分劑量相當于60 kg體質量成人每日臨床用量的10倍。共干預4周。

1.5 標本檢測 假手術組及UUO模型各組于造模后第28日處死所有大鼠。腹主動脈采血，用于指標測定。血樣經離心后留取血清。血尿素氮、肌酐的測定，用BECMAN-⊿5大型生化儀常規生化測定方法檢測。各組大鼠于造模后第28日置于代謝籠中收集24 h尿。尿標本酶聯免疫法檢測尿NAG、α1-M、RBP、β2-M含量。檢測方法嚴格按照試劑盒說明書，主要儀器為M5多功能酶標儀。

1.6 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件。計量資料以（±s）表示；采用單因素方差分析，應用Levene檢驗進行方差齊性檢驗，組間樣本兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠SCr、BUN的含量比較 見表1。3個造模組較假手術組術后SCr、BUN均有顯著升高 （P＜0.05）；與模型組比較，齊墩果酸組SCr及BUN均有明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；丹酚酸組SCr及BUN亦均有明顯減低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠SCr、BUN的含量比較（±s）

表1 各組大鼠SCr、BUN的含量比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 BUN 24 h尿蛋白定量假手術組 4.23±0.39 0.30±0.10 n SCr 12 25.30±6.98模型組 7.59±1.74△ 0.94±0.32△12 44.09±7.14△齊墩果酸組 12 34.45±2.50*△ 6.66±0.56*△ 0.39±0.10**△丹酚酸組 12 35.40±6.47*△ 5.84±0.80**△ 0.54±0.21**△

2.2 UUO模型中尿微量蛋白變化 見表2。模型組的尿TRF、α1-M、NAG、β2-M含量與假手術組比較有顯著升高（P＜0.05）。齊墩果酸組與模型組比較僅尿α1-M含量均有明顯下降（P＜0.01），NAG、β2-M、TRF水平無下降。丹酚酸組與模型組比較尿α1-M及NAG含量都有明顯下降（P＜0.01），β2-M、TRF水平無下降。

表2 各組α1-MG水平比較（ng/L±s）

表2 各組α1-MG水平比較（ng/L±s）

組別 n丹酚酸組 12假手術組 12模型組 12齊墩果酸組 12 α1-MG（ng/L） NAG（U/L）β2-MG（ng/L）TRF（nmol/L）206.19±15.60**△25.88±4.91*△ 36.83±1.75△ 216.35±19.78△196.61±9.43 19.16±2.04 35.07±2.69 172.52±50.17 226.00±15.25△ 37.21±17.33△ 38.68±1.92△ 239.33±26.27△204.20±9.02**△ 29.74±6.89△ 36.45±3.65△ 222.96±29.90△

3 討論

腎纖維化是各種原因的CKD發展至ESRD的最后共同途徑和主要的病理基礎。研究表明，腎間質纖維化可較腎小球病變更能預示腎臟損傷的預后［7］。

抗纖靈沖劑由丹參、川牛膝等組方，其主要有效成分為丹酚酸和齊墩果酸。本實驗中，齊墩果酸可以降低腎衰竭大鼠SCr水平，減少24 h尿蛋白總量，也可降低模型大鼠血BUN水平；丹酚酸可以降低腎衰竭大鼠血BUN水平，減少24 h尿蛋白總量，降低模型大鼠SCr水平，說明齊墩果酸、丹酚酸分灌胃可改善腎衰竭模型大鼠的腎小球濾過率，對腎小管重吸收功能也能起到改善作用。

抗纖靈沖劑藥味精簡，功主活血祛瘀、扶正祛濁。在臨床應用中表現了較好療效。觀察表明，抗纖靈沖劑能顯著降低患者SCr、BUN水平，其效果優于包醛氧淀粉［4］，并有明顯的改善腎臟血流動力學作用［5］；其近期療效優于福辛普利，對于早中期慢性腎功能衰竭療效顯著［6］。

近年來尿液中的生物標志物的檢測引起關注，有學者認為可以替代腎活檢術判斷疾病的進展、監測治療反應及判斷預后［8］。α1-MG、NAG、β2-MG和TRF就是常用的尿液生物標志物。其中N-乙酰-B-D氨基葡萄糖苷酶（NAG）是廣泛存在于各組織的溶酶體中的一種高分子質量（140000）酶。在腎近端小管上皮中含量最高，在正常情況下，血清中的NAG不能通過腎小球濾過膜，當腎近端小管上皮細胞受損時，溶酶體內的NAG釋放入尿而使尿中NAG升高［9］，因此，尿中NAG活性升高與腎小管（主要是近端小管）損傷密切相關。α1-MG是由人體的肝臟和淋巴細胞合成、分子量約為33000道爾頓的糖蛋白，血液中游離的α1-MG可自由通過腎小球濾過膜，多在腎近曲小管重吸收和代謝，只有微量從終尿排出，一般認為α1-MG在及尿液中增高的原因為腎小管重吸收和代謝α1-MG的能力降低，以及腎小球濾過功能受損。目前人們普遍認為血清及尿液中α1-MG的測定可作為反映腎小管重吸收功能受損的一項靈敏指標。β2-MG是由淋巴細胞、血小板、多形核白細胞產生的一種小分子球蛋白，正常β2-MG的合成率及從細胞膜上的釋放量相當恒定，可以從腎小球自由濾過，多在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細胞中分解破壞；故而正常情況下β2-MG的排出是很微量的，其測定主要用于監測近端腎小管的功能［10］。正常情況下，血漿相對分子質量＜60000的蛋白質較容易通過腎小球濾過膜，并幾乎被近端腎小管完全吸收和降解，而TRF由于分子質量較大，相對分子質量約為77000，加之由于膜電荷的選擇屏障作用，一般不從腎小球濾過膜濾出。但當腎小球的濾過屏障受損時，尿中的TRF可明顯升高。TRF被認為是更早更敏感地反映腎小球濾過膜損傷的標志性蛋白［11］。目前研究認為，對腎臟損傷的檢測指標，聯合檢測的陽性率要高于各指標的單獨檢測［12］。

有研究表明，發現UUO后大鼠尿NAG及β2-MG均顯著升高［13］。本研究發現，在UUO模型中，丹酚酸僅在降低UUO模型大鼠的尿α1-MG、NAG水平上有作用，對尿TRF、β2-M無明顯降低作用，而齊墩果酸僅在降低UUO模型大鼠的尿α1-MG水平上有作用，對尿NAG、β2-M、TRF無明顯降低作用，提示丹酚酸和齊墩果酸在改善腎衰竭腎的腎小管重吸收功能上存在一定作用，但作用機制還有待研究。根據以往的觀察，抗纖靈沖劑能減少UUO模型中的尿微量蛋白尿，改善模型中的腎損傷［14］。丹酚酸和齊墩果酸在實驗數據上看卻并不能較全面地改善UUO模型中的尿微量蛋白含量，提示抗纖靈沖劑的減少尿微量的作用機制可能為其他藥味的作用或其協同作用，這有待于進一步的研究得出結論。

［1］ Zhang L，Zuo L，Xu G，et al.Community-based screening for chronic kidney disease among populations older than 40 years in Beijing［J］.Nephrol Dial Tansplant，2007，22（4）：1093-1099.

［2］Saulo K，Jeremiah M.Obstructive nephropathy and renal fibrosis［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，283（3）：F861-F875.

［3］Neil G，Docherty，Orfhlaith E.O’Sullivan，Declan A.Healy，et al.Evidence that inhibition of tubular cell apoptosis protects against renaldamage and development of fibrosis following ureteric obstruction［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290（6）：F4-F13.

［4］章諳鳴，何立群.抗纖靈沖劑治療慢性腎衰50例觀察［J］.實用中醫藥雜志，2000，16（4）：3-4.

［5］蔡雁平，何立群.抗纖靈治療慢性腎衰30例臨床觀察［J］.中國臨床醫生，2002，30（11）：41.

［6］王怡，何立群，鄭平東.抗纖靈沖劑對慢性腎衰竭腎功能及纖維化指標影響的臨床研究［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2002，3（7）：396-398.

［7］王海燕.腎臟病學［M］.北京：人民衛生出版社，2008：801.

［8］朱立華.腎臟疾病的生化、免疫檢測技術進展［J］.中華檢驗醫學雜志，2002，25（5）：306-308.

［9］Coren MP，Wright RK.Two automated procedures for N-acetyl-β-D-glocosaminidas determiniation evaluated for detection of drug induced tubular nephrotoxicity［J］.Clin Chem，1998，32（1）：2052-2054.

［10］付強，何立群.抗纖靈對5／6腎切除大鼠腎組織核因子KB及腫瘤壞死因子α，白細胞介素6 mRNA表達的影響［J］.時珍國醫國藥，2008，19（11）：2684-2686.

［11］ Varghese SA，Powell TB，Budisavljevic MN，et al.Urine biomarkers predict the cause of glomerular disease［J］.J Am Soc Nephrol，2007，8（3）：913-922.

［12］陳慶海，府偉靈.尿微量蛋白檢測及臨床應用的研究進展［J］.國外醫學：臨床生物化學與檢驗學分冊，2002，23（3）：178-180.

［13］陳剛，周建淞，吳美，等.抗纖靈二號方對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質細胞外基質的調節［J］.江蘇中醫藥，2009，41（2）：75-77.

［14］吳鋒，沈麗萍，張新志，等.抗纖靈沖劑對單側輸尿管梗阻及再通后大鼠尿微量蛋白的影響［J］.時珍國醫國藥，2010，21（5）：1038-1040.

Effects of Oleanolic Acid and Salvianolic Acid on Rats′Kidney and Renal Tubular

ZHANG Yi，LI Li，HE Li-qun.Tongren Hospital Affliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Objective：To observe clinical effects of Kangxianling Decoction on kidney protection and to investigate function and mechanism of oleanolic acid and salvianolic acid on UUO rat model during renal interstitial fibrosis.M ethods：48 healthy male SPF Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group，model group，oleanolic acid group and salvianolic acid group，12 in each group.Levels of serum creatinine（SCr），blood urea nitrogen（BUN），24 hpro from 24 h urine，HE staining，and nephridial tissue were collected and compared for the damage after 28 days.Results：In UUO model，oleanolic acid and salvianolic acid played different roles and functions in delaying renal failure.Except for sham-operated group，renal function of rats in other groups was deteriorated while excretion of urine micro protein gradually increased and renal interstitial fibrosis gradually deteriorated.Compared with sham-operated group and model group，the levels of SCr，NAG，and 24hpro reduced significantly while in oleanolic acid group the levels of SCr，NAG，24 hpro and α1-M lowered too（P＜ 0.05或P＜0.01）.Conclusions：Oleanolic acid and salvianolic acid can improve renal function and renal tubular function，reduce Scr and UN，and decrease the excretion of urine micro protein.But the mechanisms are different.【Key words】Oleanolic acid；Salvianolic acid；Unilateral ureteral obstruction model；Renal function；Renal tubular function

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0569-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.002

國家科技重大專項資助課題（2009ZX09311-003）△通信作者

2013-12-28）