單核細胞趨化蛋白-1對大鼠腦內神經干細胞的誘導作用①

張浩，丁鵬，王進昆，蘇穩，牟臨杰，王波，龔光輝，劉景傳，王崇謙

單核細胞趨化蛋白-1對大鼠腦內神經干細胞的誘導作用①

張浩，丁鵬，王進昆，蘇穩，牟臨杰，王波，龔光輝，劉景傳，王崇謙

目的探討外源性單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)對體內神經干細胞的作用。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只分為空白組(n=4)、對照組(n=30)和實驗組(n=30)。空白組不做處理，對照組大腦皮層微量定向注射PBS液，實驗組注射MCP-1。注射后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d分別取對照組和實驗組大鼠各6只灌注取腦。免疫組織化學法觀察腦內不同部位nestin陽性細胞的分布。結果實驗組皮質區、海馬區nestin陽性細胞矯正累積吸光度隨時間延長而顯著增加(P＜0.001)。對照組和空白組之間無顯著性差異(P＞0.05)。結論外源性MCP-1可以促進MCP-1富集部位的nestin陽性細胞的數量增多。

單核細胞趨化因子-1；神經干細胞；趨化因子；nestin

[本文著錄格式] 張浩，丁鵬，王進昆，等.單核細胞趨化蛋白-1對大鼠腦內神經干細胞的誘導作用[J].中國康復理論與實踐, 2014,20(5):434-441.

20世紀90年代，Galli等從成年小鼠紋狀體分離出一種能夠在體外分裂增殖、具有多分化潛能的細胞群，稱為神經干細胞(neural progenitor/stem cells, NPCs)[1]，成年哺乳動物主要分布在大腦側腦室壁的腦室下區(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone,SGZ)。有研究表明，缺血性腦損傷能誘導體內NPCs向損傷區域遷移[2]。局部NPCs受免疫細胞分泌的多種趨化因子影響[3-4]，其中單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)可通過細胞表面趨化因子受體CCR2對海馬區增殖的神經干細胞產生化學趨化作用[5-6]。MCP-1是細胞因子超家族中CC家族的成員[7]，不僅具有趨化效應，還具有一系列調控單核細胞和淋巴細胞生物學活性的免疫學特性，參與調節機體的免疫應答。2004年，Widera等證實在Boyden小室中，MCP-1可誘導神經干細胞的遷移[8]。本研究探討外源性MCP-1對內源性神經干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

大鼠MCP-1：美國ABBIOTEC公司。抗大鼠nestin多克隆抗體：北京博奧森生物技術有限公司。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒：福州邁新生物技術開發有限公司。蘇木精-伊紅染色(HE染色)試劑盒：碧云天生物技術研究所。立體定向儀：中西遠大(武漢)科技有限公司。微量注射器：美國NANOFIL公司。大鼠開顱手術及麻醉消毒設備。LEICA RM2016型轉輪式切片機、LEICA DM1000型生物顯微鏡：德國LEICA公司。

1.2 實驗動物分組與造模

成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只，體重200～250 g，昆明醫科大學動物科提供。實驗過程中對動物的處置符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》[9]的規定。將大鼠MCP-1與PBS溶液充分混勻，制成濃度為500 ng/μl溶液。所有動物隨機編號，用隨機數表將其分為空白組(n=4)、對照組(n=30)和實驗組(n=30)。

空白組不做任何處理。

實驗組再分為3 d組、5 d組、7 d組、14 d組和21 d組，每組6只。10%水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上。備皮，常規消毒鋪巾，沿頭皮矢狀縫切開，暴露顱骨。前囟后3.5 mm矢狀線左側2.2 mm用牙鉆磨出直徑為1 mm的骨窗。10 μl平頭微量注射器嚴格消毒后吸取MCP-1 5 μl，固定于大鼠腦立體定向儀的注射架上，緩慢插入大鼠硬膜下1 mm。以1 μl/min的速度注射到大鼠皮質區。針頭留置腦內5 min后，緩慢拔出。整個過程嚴格無菌操作。骨蠟密封骨窗，縫合頭皮，肌注慶大霉素預防感染。每隔3 d重復以上操作以保證大鼠皮質的藥物濃度。

對照組再分為3 d組、5 d組、7 d組、14 d組和21 d組，每組6只。將注射液體改換為PBS液。其余操作與實驗組相同。

1.3 標本采集

將分組后的大鼠按規定時間取材。10%水合氯醛2 ml/kg腹腔內注射麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定于手術臺上，切開胸腔，暴露心臟。穿刺左心室，并切開右心耳，以生理鹽水灌洗，至右心耳灌流出液體清亮為止。夾閉腹主動脈，多聚甲醛液灌注約30 min，待大鼠上肢僵直，快速取腦。將腦組織置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定。

1.4 切片制備

腦組織按目標部位冠狀切塊，制成蠟塊；石蠟切片機連續冠狀位切片，厚4 μm。空白組和對照組選取相同部位進行切片。每5張腦片取1張，共取8張。相鄰切片分別編號，脫蠟后置于4℃冰箱中保存備用。

1.5 HE染色

各組3 d組(除空白組)標本取同部位切片2張，行HE染色。200×光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.6 nestin免疫組織化學染色

腦片3%H2O2室溫孵育，蒸餾水沖洗，PBS浸泡，10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育。滴加抗大鼠nestin多克隆抗體工作液，孵育1～2 h。滴加適量二抗工作液，孵育沖洗后，滴加適量辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，孵育，沖洗，顯色，復染，脫水，透明，封片。室溫晾干后400×顯微鏡下觀察拍片。圖片采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分析計算累積光密度(IOD）。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 大體觀察

實驗組可見細微針孔及出血點，注射部位在大腦皮質內側1 mm處，海馬上方。腦內有微量出血灶。對照組大腦解剖后表觀相同。

2.2 HE染色

空白組顯示正常頂葉皮質：細胞胞體飽滿，分布較為緊密、排列較為緊湊；細胞核呈藍色，神經元形態及染色均正常。實驗組可見神經細胞形態的細胞增多，未見梗死區及感染后炎性細胞富集區。對照組鏡下與實驗組差別不大，未見梗死區，無纖維素滲出和炎癥細胞富集等感染灶。見圖1。

圖1 HE染色結果(200×)

2.3 nestin免疫組化染色

nestin免疫反應陽性產物為稍淡染的棕黃色點狀或顆粒狀沉積，主要在胞質內，部分呈聚集分布[10-11]。

對照組和空白組皮質區nestin少量表達，且無顯著性差異(P＞0.05)。實驗組各時間點nestin陽性細胞均顯著高于對照組(P＜0.001)。見表1。

形態學觀察，3 d時皮質注射部位未見明顯nestin陽性細胞；5 d時皮質注射部位可見明顯nestin陽性細胞，并且呈規律分布；7 d時，皮質注射部位可見大量呈規律分布的nestin染色陽性細胞；14 d時，皮質注射部位可觀察到鏈狀分布的nestin陽性細胞；21 d時，皮質注射部位可觀察到大量規律分布的nestin陽性細胞。見圖2～圖7。

空白組和對照組海馬區nestin少量表達，且無顯著性差異(P＞0.05)。實驗組各時間點nestin陽性細胞均顯著高于對照組(P＜0.001)。見表2、圖7～圖12。

表1 各組各時間點皮質區nestin表達(IOD)

表2 各組各時間點海馬區nestin表達(IOD)

圖2 對照與實驗3 d組皮質區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖3 對照與實驗5 d組皮質區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖4 對照與實驗7 d組皮質區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖5 對照與實驗14 d組皮質區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖6 對照與實驗21 d組皮質區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖7 空白組nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖8 對照與實驗3 d組海馬區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖9 對照與實驗5 d組海馬區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖10 對照與實驗7 d組海馬區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖11 對照與實驗14 d組海馬區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

圖12 對照與實驗21 d組海馬區nestin表達(免疫組織化學染色，400×)

3 討論

迄今為止，研究者對于MCP-1[12]等趨化因子促進神經干細胞遷移方面的研究已經做出很大努力，并取得了一些重要進展。但在活體中，人們只在腦出血[13-14]、顱腦損傷[11,15]等病理環境下有一定研究。由于活體內損傷和缺血有著不同的微環境，所以我們不能直接將體外研究結果引入體內。對于體內趨化因子對神經干細胞的作用尚不明了。

趨化因子是指具有趨化作用的細胞因子。根據靠近分子氨基端(N端)的前兩個C之間是否插入其他種類氨基酸，將它們分為4個亞類：CC、CXC、CX3C和C[16-17]。MCP-1是趨化因子CC亞家族的成員。近年來研究顯示，趨化因子不僅在保護宿主、炎癥反應、過敏反應，免疫細胞的發育、分化及免疫系統的自身穩定等方面起作用，而且在腫瘤的形成及轉移、中樞神經系統神經網絡的發育、損傷與疾病修復過程、心腦血管系統疾病的修復過程等方面都發揮重要作用[18-20]。Belmadani等觀察到，將小鼠MCP-1基因敲除后，神經前體細胞向損傷處的遷移顯著減少[21]，說明MCP-1可誘導神經前體細胞向MCP-1富集部位遷移。近年來也有研究表明其對神經干細胞的趨化也有重要作用。

nestin是胚胎期神經干細胞的標記物[10]。McKay等在實驗中發現一種表達于神經干細胞胞質內的蛋白，其在神經胚形成時開始表達，并隨神經細胞分化的完成而停止表達[22]。他們將這種蛋白命名為神經元中間絲蛋白(intermediate neurofilament protein)[23]，即nestin。目前很多學者將nestin作為神經干細胞的標記物[22]。

本研究通過注射MCP-1，建立SD大鼠模型。該方法比Magge等放置引流管的方法[24]降低感染和異物引起的局部炎癥反應，從而降低了炎癥細胞分泌MCP-1對實驗的干擾。同時由于針孔所致的傷口和骨窗微小，故定位準確。我們采用立體定向儀定位，可重復性較高。

本研究顯示，隨著時間延長，實驗組皮質區和海馬區的nestin陽性細胞逐漸增多。海馬區為腦內神經干細胞的富集部位，MCP-1對海馬區神經干細胞有激活效應；而皮質區nestin陽性細胞的富集提示MCP-1對內源性nestin陽性細胞的趨化效應。與Belmadani等[21]結果相似。

因此，外源性MCP-1既可激活神經干細胞，也可誘導神經干細胞向目標部位富集，為應用趨化因子誘導神經干細胞修復腦損傷，改善顱腦損傷患者的康復過程，提供了基礎。

但神經干細胞受趨化因子誘導后的細胞內信號轉導過程還不清楚。我們將進一步研究MCP-1對于神經干細胞內信號轉導過程的影響。

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Effect of Exogenous Monocyte Chemoattractant Protein-1 on Neural Stem Cells in Brain of Rats

ZHANG Hao,DING Peng,WANG Jin-kun,et al.Department of Neurosurgery,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,Yunnan,China

ObjectiveTo apply the exogenous monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)to induce the neural stem cells in vivo.Methods64 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank(n=4),control(n=30)and experimental(n=30)groups.The experimental group was injected with MCP-1 into the cerebra,and the control group with PBS,and the blank group with no intervention. The number of nestin positive cells in brain was observed with immunohistochemistry 3,5,7,14,21 days after injection.ResultsThe number of nestin positive cells increased with time in the cortex and hippocampus in the experimental group(P＜0.001).There was no significant difference between the control group and the blank group(P＞0.05).ConclusionExogenous MCP-1 may induce the increase of neural stem cells in vivo.

monocyte chemoattractant protein-1;neural stem cells;chemotactic factor;nestin

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.05.011

R338.1

A

1006-9771(2014)05-0434-08

2013-08-27

2013-11-05)

云南省衛生科技內設研究機構項目(No.2011ws0050)。

昆明醫科大學附屬第一醫院神經外科，云南昆明市650032。作者簡介：張浩(1987-)，男，漢族，山西晉城市人，碩士研究生，主要研究方向：神經干細胞基礎應用及腦血管病的治療。通訊作者：王崇謙(1963-)，男，漢族，云南昆明市人，副主任醫師，主要研究方向：神經干細胞基礎應用及顱腦損傷。