絞股藍皂苷對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝纖維化影響*

趙世印，邱華，賀琴，李德梅，譚華炳

(1．湖北醫藥學院附屬人民醫院感染性疾病科、肝病研究室，十堰 442000；2．湖北省房縣紅塔鎮衛生院內科，房縣 442100)

絞股藍皂苷對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝纖維化影響*

趙世印1，2，邱華1，2，賀琴1，李德梅1，譚華炳1

(1．湖北醫藥學院附屬人民醫院感染性疾病科、肝病研究室，十堰 442000；2．湖北省房縣紅塔鎮衛生院內科，房縣 442100)

目的觀察絞股藍皂苷(GPS)對2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝纖維化的影響。方法通過高脂飼養聯合鏈脲佐菌素注射建立T2DM并發NAFLD模型(M組)、NAFLD模型(NM組),T2DM并發NAFLD模型給予GPS(1 g·kg-1·d-1)(JH組),GPS(0.5 g·kg-1·d-1)干預(JL組)。定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA);檢測血糖(BG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、透明質酸(HA)的變化;免疫組化染色檢測肝組織層粘連蛋白(LN)表達。結果肝組織α-SMA表達:以空白對照組(N組)擴增倍數為1計算,M組為3.17,與N組比較差異有統計學意義(P<0.01);NM組為2.37,與N組比較差異有統計學意義(P<0.01);JH組為2.26,與M組比較差異有統計學意義(P<0.01);JL組為2.63,與JH組比較差異有統計學意義(P<0.05)。肝組織LN免疫組織化學檢測:M組LN沉積最嚴重,JL與NM組程度相似;JH組LN沉積最輕。HA變化:M組、NM組、JH組、JL組明顯上升,與N組比較差異有統計學意義(P<0.01),JH組、JL組與M組比較差異有統計學意義(P<0.01)。血糖水平:JH組(10.86±3.46)mmol·L-1、JL組(14.78±3.39)mmol·L-1,與M組(18.84±4.24)mmol·L-1比較差異有統計學意義(P<0.01)。血TG水平:JH組(1.83±0.56)mmol·L-1、JL組(2.82±0.66)mmol·L-1,與M組(3.97±0.64)mmol·L-1比較差異有統計學意義(P<0.01)。血TC水平:JH組(1.41±0.10)mmol·L-1,JL組(1.49±0.20)mmol·L-1,與M組(1.85±0.12)mmol·L-1比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論GPS能降低T2DM合并NAFLD大鼠肝纖維化程度。

絞股藍皂苷；糖尿病,2型；肝病,脂肪性,非酒精性；肝纖維化

2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus,T2DM)患者非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)檢出率為50.45%［1］；合并NAFLD的T2DM人群發生心血管疾病的風險增加［2］；NAFLD被認為與至少20%原因不明的肝硬化病例密切相關［3］；T2DM是肝硬化發生的一個重要危險因素［4］。研究T2DM合并NAFLD肝纖維化對預防肝硬化具有重要意義。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)在肝纖維化形成過程中具有核心作用。激活的HSC發生表型轉變成為肌成纖維細胞,特異性表達α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA),大量合成細胞內基質(extracematrix,ECM),產生纖維化［5］。透明質酸(hyaluronic acid,HA)、層粘連蛋白(laminin,LN)是肝纖維化的兩個重要指標,筆者在本研究中通過定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術檢測肝組織α-SMA、免疫組化檢測肝組織LN、檢測血液HA,觀察絞股藍皂苷(gypenosides,GPS)對T2DM并發NAFLD大鼠肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠65只,體質量220～250 g,由湖北醫藥學院動物實驗中心提供,合格證號:SCXK(湘)2009-0004。實驗場地湖北省十堰市實驗動物中心(湖北省實驗動物設施使用證明號: 00015644)。

1.2 實驗飼料 普通飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成,蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按實驗配方配制使用(配方:78%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按照實驗設計配方配制使用(配方:82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3 材料與設備 全自動生化檢測儀(瑞士產, Roche/Hitache7600),三酰甘油(triglycerides,TG)、膽固醇(cholesterol,TC)、血糖(blood glucose,BG)檢測試劑為公司原裝進口試劑。SN-697型全自動雙探頭放射免疫γ計數器(上海原子核研究所四環儀器一廠)；HA、LN試劑購自北京北方生物技術研究所。冷凍低溫離心機(上海中科生物醫學高科技開發有限公司, DL-45R-L)。鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)購自Sigma公司。GPS 購自安康東科麥迪森天然藥業有限公司,純度為98%。肝組織LN免疫組織化學染色檢查使用武漢谷歌生物科技有限公司全套設備,LN抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(bs0821R)。α-SMA檢測設備和試劑為武漢谷歌生物科技有限公司全套設備、試劑。

1.4 實驗模型的建立

1.4.1 實驗動物的分組 大鼠購入后,飼養觀察1周。按照實驗設計將65只大鼠分為空白對照組(7只,N組),NAFLD模型組(NM組,7只),T2DM并NAFLD模型組(51只)。

1.4.2 實驗動物的管理 參照文獻［6］,每只鼠每天高糖高脂飼料約20 g,分兩次投入,喂養4周；大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ 40 mg·kg-1,48 h后尾靜脈取血,BG>11.1 mmol·L-1,納入實驗組,造模成功率為100%；繼續給予高糖高脂飼料喂養至8周,期間大鼠死亡15只。將全部大鼠分為GPS大劑量組(9只,JH組),灌胃給予GPS 1 g·kg-1·d-1；GPS小劑量組(9只,JL組),灌胃給予GPS 0.5 g·kg-1·d-1；T2DM并發NAFLD模型對照組(9只,M組)灌胃給予同體積的純凈水；繼續給予高糖高脂飼料,自由飲水；治療周期為6周；實驗周期14周。N組每天給予普通飼料約20 g(根據NAFLD組進食量調整)；NM組給予高脂飼料約20 g(依據前1 d進食量決定第2天進食量)；飼料分2次投入。自由飲水。實驗周期14周。

1.5 標本的采集與檢測

1.5.1 血液標本的采集與處理 實驗結束時,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,暴露腹主動脈,經腹主動脈采集血液10 mL分別置于肝素管和促凝管,離心取血漿和血清,保存于-20℃的冰柜中待檢。同步按儀器和試劑說明書要求,檢測血漿TG、TC、BG和血清HA、LN。

1.5.2 α-SMA檢測設備、試劑、方法 總RNA抽提按Trizol說明書進行。反轉錄(取PCR管,加入含RNA 2μg的溶液；加入1μL oligo(dT)15；用無核糖核酸酶的去離子水補足至12μL；于PCR儀上70℃保溫5 min,迅速置冰上冷卻；依次加入4μL 5×buffer,2μL 10 mmol·L-1dNTPs,RNA inhibitor和反轉錄酶各1μL,用移液器抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫30 min,結束后80℃保溫5 min滅活反轉錄酶)。定量PCR(取0.2 mL PCR管,配制如下反應體系,每個反轉錄產物配制3管,2×qPCR Mix 12.5μL, 2.5μmol·L-1基因引物2.0μL,反轉錄產物2.0μL, ddH2O 8.5μL；取0.2 mL PCR管,配制如下反應體系,每個反轉錄產物配制3管,2×qPCR Mix 12.5μL, 2.5μmol·L-1內標引物2.0μL,反轉錄產物2.0μL,ddH2O 8.5μL)。PCR擴增(預變性95℃1 min,循環(40次)95℃,15 s→58℃,20 s→72℃,20 s,末段延72℃5 min,溶解曲線72℃→95℃,每20 s升溫1℃)。結果處理采用ΔΔCT法。

1.5.3 肝組織免疫組織化學染色檢測LN 按石蠟切片免疫組織化學檢測操作常規進行。

1.6 統計學方法 所有數據采用SPSS 9.0版統計學軟件處理,數據以均數±標準差(±s)表示,治療前后組內及組間比較用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗過程中大鼠數量 模型組在T2DM并NAFLD造模過程中,死亡大鼠15只,死亡率為29.41%；在干預過程中,JH組、JL組、M組分別有1, 2,3只大鼠死亡,實驗結束JH組大鼠8只,JL組7只, M組6只,NM組6只。N組大鼠飼養過程中無死亡。

2.2 HA變化 M組、NM組、JH組、JL組與N組比較差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05),JH組、JL組低于M組,差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.3 TG、TC、BG檢測值 M組、NM組、JH組、JL組與N組比較差異有統計學意義(P<0.01)；JH組、JL組與M組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.4 α-SMA表達變化 以N組擴增倍數為1計算,M組為3.17,與N組比較差異有統計學意義(P<0.01)；NM組為2.37,與N組比較差異有統計學意義(P< 0.01)；JH組表達降至2.26,與M組比較差異有統計學意義(P<0.01)；JL組表達降至2.63,與JH組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 肝組織免疫組織化學染色檢測 M組LN沉積最嚴重,JL與NM組程度相似；JH組LN沉積最輕。見圖1。

3 討論

肝纖維化是慢性肝病向終末型肝病發展的必由之路。抑制肝纖維化就是抑制終末型肝病的發生。近年來,由T2DM、NAFLD等代謝性疾病導致的肝纖維化已經成為肝纖維化的主要原因。研究T2DM合并NAFLD具有重要意義。

表1 5組大鼠BG、TG、TC、HA的測定值Tab.1 Determination results of BG,TG,TC and HA in five groups of rats ±s

表1 5組大鼠BG、TG、TC、HA的測定值Tab.1 Determination results of BG,TG,TC and HA in five groups of rats ±s

與N組比較,*1P<0.01,*4P<0.05;與M組比較,*2P<0.01,*3P<0.05Compared with N group,*1P<0.01,*4P<0.05;Compared with Mgroup,*2P<0.01,*3P<0.05

組別大鼠/只BG TG TC (mmol·L-1) HA/ (ng·mL-1) M組6 18.84±4.24*13.97±0.64*11.85±0.12*1280.86±24.24*1NM組6 9.84±3.25*1*22.76±0.72*1*31.47±0.13*3*4204.34±19.56*1*2JH組8 10.86±3.46*1*21.83±0.56*1*21.41±0.10*3*4199.92±18.28*1*2JL組7 14.78±3.39*1*32.82±0.66*1*31.49±0.20*3*4238.26±20.86*1*2N組7 5.65±0.52 0.96±0.09 1.10±0.10 64.12±6.98

圖1 肝組織LN免疫組織化學染色(×400)N.正常對照組;M.模型組;NM.非酒精性脂肪性肝病組;JH.大劑量GPS干預組;JL.小劑量GPS干預組Fig.1 Immunohistochemical staining on Laminin in hepatic tissue(×400)N.normal control group;M.model group;NM.Nonalcoholic fatty liver;JH.model group treated with high-dose GPS;JL.model group treated with low-dose GPS

本研究肝臟病理學、BG、TG、TC檢測顯示M組、JH組、JL組T2DM并NAFLD模型及NM組NAFLD模型已經建立,血糖、血脂檢測顯示GPS大、小劑量均有降低血糖、調整血脂代謝作用,并呈劑量依賴性［7］；GPS具有劑量依賴性干預T2DM并發NAFLD脂肪肝程度的作用。

HSC的激活和增殖,HSC活化是肝纖維化的中心環節［8］。α-SMA是HSC活化程度和肝纖維化進展的一個重要指標已經為學界所認同。本研究顯示,T2DM并發NAFLD、NAFLD大鼠均有明顯α-SMA表達,JH組、JL組均有降低α-SMA表達的作用,說明GPS具有抑制HSC激活和增殖,從而抑制纖維化作用。

HA濃度升高被認為與HSC合成和分泌增多,及肝竇內皮細胞(LSEC)攝取和降解功能減退有關,HA是反映LSEC表型發生改變的標志。LN可作為肝竇毛細血管化基底膜形成的一個重要標志［9］。LSEC是特殊化的毛細血管內皮細胞,在肝竇形成無隔膜、無BM的窗孔(fenestrae),窗孔結構有利于肝細胞和血液之間進行物質交換,在維持肝臟結構和實現各種功能中起著非常重要的作用,HA、LN的升高提示ECM生成增多、吸收減少,肝纖維化加重。肝臟LN免疫組化顯示JH組、JL組LN表達較M組顯著下降,JH組輕于JL組；血液生化檢驗提示與M組比較,JH組、JL組HA、LN下降,具有劑量依賴性。進一步說明GPS具有抑制肝纖維化作用。

中醫認為T2DM并發NAFLD是由于濕熱內蘊、痰瘀互結,需要清熱解毒。絞股藍是傳統的清熱解毒藥物。現代藥理研究證明,絞股藍含有83種與人參皂苷有類似骨架達瑪烷型GPS,皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調節等多方面的生物活性和藥理作用［10］,NORBERG等［11］從絞股藍中分離提純出一種新的皂苷,存在4種可以相互轉化的立體異構體,在體外及動物實驗中均發現,其可刺激胰島細胞釋放胰島素,且呈現劑量依賴性。XU等［12］對絞股藍中分離得到的皂苷及其衍生物的降糖作用進行了研究,發現其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度。說明GPS具有降低血糖作用。高血糖可促進大鼠肝纖維化形成及HSC的活化［13］,GPS通過多種機制對血糖升高具有抑制作用,這可能是GPS抑制T2DM并發NAFLD大鼠肝纖維化的另一機制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.006

Effect of Gepenoside on Hepatic Fibrosis of Rats with Type 2 Diabetes Mellitus and Nonalcoholic Fatty Liver Disease

ZHAO Shi-yin1,2,QIU Hua1,2,HE Qin1,LI De-mei1,TAN Hua-bing1
(1.Department of Infectious Disease and Liver Disease,Renmin Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Internal Medicine,Fangχian Hongta Township Health Hospital,Fangχian 442100,China)

Objective To investigate the effect of gepenoside(GPS)on hepatic fibrosis of rats with type 2 diabetes mellitus(T2DM)and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsT2DMand NAFLD model(group M)and NAFLD model(group NM)were established by feeding the ratswith high-fat diet and injection of streptozotocin.The T2DMand NAFLDmodelwas administered with GPS(1 g·kg-1·d-1)(group JH)or GPS(0.5 g·kg-1·d-1)(group JL).α-SMA in the liver tissueswas determinied by quantified PCR.Blood glucose,triacylglycerol(TG),total cholesterol(TC)and hyaluronic acid were examined.Laminin(LN)expression in liver tissues was detected by immunohistocheministry.Resultsα-SMA expression in the liver tissueswas as follows:the amplification ofα-SMA in group N was regarded as1,and that in group Mwas 3.17,with significant difference(P<0.01);The amplification ofα-SMA in group NMwas 2.37(P<0.01 vs.group N);That was 2.26 in group JH(P<0.01 vs.group M);Thatwas2.63 in group JL(P<0.05 vs.group JH).LN expression levelswere as follows:greatest in group M,middle in group JL and MN,lowest in group JH.HA was significantly increased in groups M,NM, JH,and JL(P<0.01 vs.group N).There were significant differences in HA between group JH,JL and group M(P<0.01). There were significant differences in blood glucose levels,TG and TC between group JH［(10.86±3.46),(1.41±0.10)and (1.83±0.56)mmol·L-1］,group JL［(14.78±3.39),(1.49±0.20)and(2.82±0.66)mmol·L-1］and group M［(18.84±4.24),(1.85±0.12)and(3.97±0.64)mmol·L-1］(P<0.01).Significant differences in blood glucose and TG were also found between group JH and group JL(P<0.05,P<0.01).ConclusionGPS can alleviate hepatic fibrosis of rats with T2DMand NAFLD.

Gypenoside;Diabetesmellitus,type 2;Liver disease,fatty,non-alcoholic;Hepatic fibrosis

R965

A

1004-0781(2014)02-0156-04

2013-04-05

2013-05-22

*2009年湖北省衛生廳科研項目(JX4B59)。

趙世印(1963-),男,湖北房縣人,副主任醫師,主要研究方向:從事中西醫結合內科臨床工作。電話:0719-3224515。

譚華炳(1963-),湖北房縣人,男,主任醫師,教授,學士,主要研究方向:從事肝病臨床教學科研工作。電話: (0)13707287512,E-mail：renmthb@163.com。