6-羥基-1H-吲唑抑制Tau磷酸化對MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞保護作用的研究

朱雯婷，梁小鳳，饒進軍，王文雅

（南方醫科大學藥學院臨床藥理研究所，廣東廣州 510515）

帕金森（Parkinson’s disease，PD）是中、老年人常見的一種中樞神經系統錐體外系功能障礙的慢性進行性疾病。其主要病理表現是黑質多巴胺（DA）神經元選擇性變性死亡，中樞神經遞質DA含量減少［1］。導致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚，可能是多種因素共同作用的結果。研究表明，神經元凋亡在PD等神經退行性疾病的發病機制中起著關鍵作用［2］。因此，研究神經元凋亡的信號通路將為揭示神經元凋亡提供一個理論基礎。多條信號傳導通路，如c-Jun氨基末端激酶通路［3］、細胞周期再激活、p53的激活［4］、Bcl-2家族蛋白以及通過GSK-3／Tau通路的信號通路等介導了PD黒質神經元凋亡。Tau磷酸化是多條PD相關神經元凋亡信號通路的匯合點［5］，Tau蛋白是中樞神經系統中重要的微管相關蛋白，其功能受磷酸化調節。在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）／1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP＋）誘導的PD模型中（離體的細胞模型和整體的動物模型），黑質多巴胺能神經元內Tau蛋白（Ser396）異常磷酸化［6］。

既然Tau磷酸化與PD的發病機制相關，并且有研究表明抑制Tau磷酸化可以減少神經元的凋亡［7］。我們篩選了一系列能夠抑制Tau磷酸化的化合物，發現6-羥基-1H-吲唑具有神經保護作用。6-羥基-1H-吲唑是一種有機化合物，其化學結構如Fig 1所示。用MPP＋作用于人神經母細胞瘤細胞SHSY5Y制作PD的細胞模型，觀察6-羥基-1H-吲唑對MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞是否具有作用，并探討其可能的機制。

Fig 1 Structure of 6-Hydroxy-1H-indazole

1 材料與方法

1.1 細胞 人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y由中山大學中山醫學院藥理教研室惠贈。

1.2 藥品 高糖 DMEM（Dulbecco’smodified eagle medium）培養基購自 Hyclone。6-羥基-1H-吲唑、Hoechst33258、四氮唑鹽（MTT）、MPP＋均購自 Sigma，在細胞實驗中，6-羥基-1H-吲唑用DMSO溶解，配成100×的儲備液，直接加到培養基中，使終濃度分別為 0.001、0.01、0.1、1、10和100μmol·L－1。MPP＋用無血清的DMEM培養基配成100×1 mmol·L－1儲備液，加到培養基中。

1.3 抗體 特異性磷酸化Tau（Ser396）的羊多克隆抗體和特異性酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的兔多克隆抗體均購自Santa Cruz。

1.4 儀器 CO2組織培養箱（美國Forma Scientific公司）；超凈工作臺（蘇州儀器四廠）；倒置光學顯微鏡（日本Nikon公司）；冷凍離心機（德國Eppenddorf公司）；酶標儀（BIO-RAD公司）；電泳儀（BIO-RAD公司）；半干轉膜儀（BIO-RAD公司）。

1.5 SH-SY5Y細胞培養 SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清的高糖 DMEM培養基在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。消化傳代接種在96或24孔細胞培養板，待細胞貼壁后，加入不同濃度的6-羥基-1H-吲唑，2 h后加入 MPP＋，培養48 h之后，按文獻報道的方法進行，以MTT法檢測6-羥基-1H-吲唑對 SH-SY5Y細胞的保護作用；以 Hoechst33258染色法［8］觀察 6-羥基-1H-吲唑對細胞核典型凋亡形態學的影響；以ABC法觀察6-羥基-1H-吲唑對細胞內TH含量的影響；MPP＋處理8 h后，做TH和磷酸化Tau的免疫熒光雙染［9］，觀察6-羥基-1H-吲唑對MPP＋誘導的Tau過磷酸化的影響。在倒置熒光顯微鏡下隨機拍照。

1.6 免疫印跡 棄培養液，用預冷的PBS漂洗細胞2次，每孔加入細胞裂解液 SDS 2 g、Tris堿0.7571 g、溴酚藍 0.01 g、DTT 0.771 g、去離子水 90 ml、甘油10ml150μl冰面上裂解20 min，超聲粉碎DNA 12 s后，（95～100）℃水浴中煮沸5 min，冷卻后置于高速離心機以4℃、12 000 r·min－1離心10 min。考馬斯亮藍法進行蛋白定量。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉移法轉移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉1 h后加入用封閉液稀釋的一抗4℃過夜，d 2取出室溫孵育二抗2 h，ECL顯色液兩種顯色底物1∶1等體積混合顯色，壓膠片曝光，β-actin作為內參照。掃描膠片，運用gerpro analyzer對Western blot條帶進行半定量分析，目的蛋白的條帶的密度與β-actin相比，用相對光密度（relative optical density，ROD）來表示。

1.7 統計學處理 實驗結果以ˉx±s表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 MPP＋濃度依賴性地誘導SH-SY5Y細胞凋亡

MPP＋對SH-SY5Y細胞的毒性成濃度依賴性，在200μmol·L－1MPP＋作用 SH-SY5Y細胞48 h后，與空白組細胞相比，其細胞存活率降至（47.80±0.84）%（P＜0.01）（Fig 2）。

Fig 2 MPP＋induces SH-SY5Y cells apoptosis in a dose-dependentmannerCells were treated with various concentrations（0.002～1 mmol·L－1）of MPP＋for 48 h.The cell viability was analyzed by the conventional MTT reduction assay.**P＜0.01 vs control.

2.2 MPP＋誘導SH-SY5Y細胞內 Tau蛋白過度磷酸化 Western bolt結果顯示 200μmol·L－1MPP＋處理2 h之后，p-Tau（Ser396）水平開始升高，在8 h達到高峰，隨后逐漸下降。表明MPP＋作用SH-SY5Y細胞會導致Tau蛋白過度磷酸化（Fig 3）。

Fig 3 MPP＋induces hyperphosphorylation of Tau（Ser396）in cultured SH-SY5Y cellsSH-SY5Y cellswere treated with 200μmol·L－1 MPP＋ for 0，2，4，8，16 and 24 h respectively.The levels of p-Tau（Ser396）were detected by Western blotwith the specific antibodies.**P＜0.01 vs control group.

2.3 6-羥基-1H-吲唑對 MPP＋誘導凋亡的 SHSY5Y細胞具有保護作用 提前2 h加入0.001、0.01、0.1、1、10和 100μmol·L－16-羥基-1H-吲唑，200μmol·L－1MPP＋孵育48 h，細胞存活率與空白組 相 比 分 別 為 （70.36±0.36）%、（67.86±3.77）%、（67.57±3.11）%、（63.84±1.43）%、（61.22±0.54）%和（59.86±1.34）%（P＜0.01）（Fig 4A）。用ABC法檢測細胞內殘余多巴胺神經元的數目，與溶劑對照組相比，MPP＋導致多巴胺能神經元大量丟失，而0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑會明顯的抑制因MPP＋毒性所引起的TH陽性細胞數目的減少（Fig 4C，D）。0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑在不加MPP＋的情況下單獨作用于細胞，與空白組相比細胞存活率的改變沒有統計學意義（Fig 4B）。

2.4 6-羥基-1H-吲唑對 MPP＋誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡具有抑制作用 用Hoechst 33258染色檢測細胞內細胞核的凋亡情況。在溶劑對照組內，細胞核形態正常（Fig 5A）。在200μmol·L－1MPP＋處理48 h之后，引起了細胞核體積縮小（白色箭頭顯示核固縮）（Fig 5B），在用0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑預處理2 h之后，核固縮明顯減輕（Fig 5C）。

2.5 6-羥基-1H-吲唑對 MPP＋誘導的SH-SY5Y細胞內Tau蛋白過磷酸化水平的影響 免疫熒光雙染發現在溶劑對照組，TH-陽性細胞內有微弱p-Tau（Ser 396）的表達，雙染的SH-SY5Y細胞呈現黃色；MPP＋處理8 h后，TH-陽性細胞內 p-Tau（Ser396）水平明顯升高，雙染細胞顯示橙紅色；0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑預處理 2 h后，細胞內 p-Tau（Ser396）水平明顯下降，雙染細胞顯示黃色（Fig 6）。

Western blot的結果顯示 MPP＋處理8 h后，0.1 μmol·L－16-羥基-1H-吲唑使細胞內 p-Tau（Ser396）表達水平與MPP＋組比較明顯降低（Fig 7）。

Fig 4 Effect of 6-Hydroxy-1H-indazole on MPP＋-induced decrease in SH-SY5Y cell viabilityA：Cell viability exposed to MPP＋ with or without6-hydroxy-1H-indazole.Cells were pretreated with various concentrations（0.001-100μmol·L－1）of6-hydroxy-1H-indazole for2 h and then treated with 200μmol·L－1 MPP＋for48 h；B：Cellswere treated with 200μmol·L－1 MPP＋in absence or presence of0.1μmol·L－1 6-hydroxy-1H-indazole for 48 h as described；C：Quantification of TH-positive cellswas carried outas described in the Materials and Methods；D：Immunocytochemistry staining of TH-positive cells，a）vehicle treated（control）；b）MPP＋treated；c）along with 6-hydroxy-1H-indazole 0.1μmol·L－1.Note themarked reduction in TH-positive cell after treated with 200μmol·L－1 MPP＋.6-hydroxy-1H-indazole at 0.1μmol·L－1 significantly protected TH-positive neurons from death induced by MPP＋ exposure（×200）.＃＃P＜0.01 vs control；**P＜0.01 vs MPP＋.

3 討論

PD是一種常見的神經退行性疾病，PD患者的黑質致密部會出現路易小體和路易神經突起，多巴胺能神經元發生凋亡。路易小體最初是在神經纖維纏結中被發現的，聚集的過磷酸化的Tau蛋白是神經纖維纏結的主要成分，構成毒性分子，可獵獲神經元中其他正常的微管蛋白，使微管結構崩解，神經元退變［10］，推測Tau蛋白磷酸化和PD黑質神經元凋亡有一定的關系。在PD患者的腦部神經突觸富集的地方發現Tau的Ser396位點過度磷酸化，同時伴隨著α-突觸核蛋白的磷酸化［11］，進一步確定Tau蛋白磷酸化在PD的發病機制中起著重要的作用。

Fig 5 Nuclear-stained figures of 6-Hydroxy-1H-indazole inhibitory effect on SH-SY5Y cells apoptosis induced by MPP＋A：Control，vehicle-treated cells；B：200μmol·L－1 MPP＋induced apoptosis；C：Alongwith 6-Hydroxy-1H-indazole0.1μmol·L－1.Note nuclear condensation and heterochramatin clumping，the typical apoptotic morphology in b，but few in a and c（×200）.

Fig 6 6-Hydroxy-1H-indazole attenuates MPP＋-induced hyperphosphorylation of Tau（Ser396）in cultured SH-SY5Y cellsDetection of p-Tau（Ser396）expression by immunocytochemicalwas at8 h after MPP＋treatment in cultured SH-SY5Y cells.Specific TH-antibody was used to detect dopaminergic neurons.Vehicle-treated cultures showed low phosphorylative levels on Tau（Ser396）（red）in TH positive cells.Note more Tau（Ser396）were phosphorylated in MPP＋treated cells，resulting in neurons stainingwith salmon pink（white arrow），and MPP＋-increased Tau（ser396）phosphorylation in TH positive neurons could be prevented by 0.1μmol·L－1 6-Hydroxy-1H-indazole（×200）.

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y是一種具有多巴胺能神經元和膽堿能神經元特征的細胞［12］。TH是一種非血紅素鐵蛋白，體內TH主要分布于中樞兒茶酚胺（catecholamines，CA）能神經元、外周交感神經節非腎上腺素能神經元、交感神經纖維、腎上腺髓質非腎上腺素能和腎上腺素能細胞。在腦內，TH催化CA類神經遞質體內合成的起始步驟，即L-酪氨酸羥化形成 L-多巴（L-DOPA）的反應。與參與CA合成步驟的其他催化酶相比，TH含量最少、合成速率最低、催化活性最弱且底物專一性最強，因而被認為是包括DA在內的CA合成的限速酶。TH同時還是腦內多巴胺神經元的蛋白標志，TH免疫組織化學方法（TH-IR）常被用于顯示DA能神經元細胞體及其突起。因此我們在實驗中使用TH的免疫細胞化學方法標示SH-SY5Y細胞。大量研究證實動物注射MPTP可以復制出黑質多巴胺能神經元選擇性退化的過程，并且出現PD類似的行為和病理特征，同時其活性代謝產物MPP＋能夠誘導體外培養的多巴胺能神經元凋亡，所以現在MPP＋體外作用于SH-SY5Y細胞已經被廣泛運用于藥物篩選［13］。實驗結果顯示，MPP＋可導致SH-SY5Y細胞的存活率降低，且呈現濃度依賴性，IC50為（193±3.1）μmol·L－1，其中 200μmol·L－1的 MPP＋作用SH-SY5Y細胞48 h后，細胞的存活率為（47.80±0.84）%（P＜0.01），因此選取 48 h和 200μmol·L－1MPP＋作用于SH-SY5Y細胞作為PD的細胞模型。

Fig 7 6-Hydroxy-1H-indazole decreases p-Tau（Ser396）which was increased by MPP＋SH-SY5Y cells were treated with 200μmol·L－1 MPP＋ for 8 h.The levels of p-Tau（Ser396）were detected by Western blot with the specific antibodies.＃＃P＜0.01 vs control；**P＜0.01 vs MPP＋.

我們在先前的實驗中亦證實，色霉素A3（chromo-mycin A3）是一個抗癌藥物，抑制 Tau（Ser396）磷酸化，進而抑制MPP＋誘導的體外培養的多巴胺能神經元的凋亡［14］。特異性的GSK-3β抑制劑ARA014418可降低Tau磷酸化，對PD動物起治療作用［9］。研究也發現，Rho激酶 （ROCK）抑制劑通過抑制CDK5對Tau的磷酸化而改善全腦缺血模型鼠的學習和空間記憶能力［15］。上述實驗結果提示：抑制Tau蛋白磷酸化可以減少神經元的凋亡。因此我們通過美國一個專利（US7629374B2，USE OF AMINOINDAZOLE DERIVATIVES FOR THE INHIBITION OF TAU PHOSPHORYLATION），選擇一些結構類似物，篩選發現氨基吲唑衍生物能夠抑制Tau蛋白磷酸化，進一步發現6-羥基-1H-吲唑的保護作用。用 0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑作用 SHSY5Y細胞2 h后再孵育MPP＋48 h，發現細胞的存活率明顯增高，為（63.84±1.43）% （P＜0.01）。同時細胞單獨用 0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑在不加MPP＋情況下作用，發現其細胞的存活率與溶劑對照組間的差異沒有統計學意義，說明藥物本身沒有毒性。TH的ABC染色發現，在單獨MPP＋作用的組別，TH陽性細胞的數目明顯減少，而用0.1 μmol·L－16-羥基-1H-吲唑作用的組別均可保護性干預MPP＋對多巴胺能神經元的毒性，減少TH陽性細胞數目的死亡。Hoechst 33258染色結果顯示，單用MPP＋組的細胞核內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，而在用6-羥基-1H-吲唑處理的細胞內，細胞呈彌散的均勻熒光，說明6-羥基-1H-吲唑能明顯的減輕MPP＋誘導的細胞凋亡。

Western blot免疫印跡檢測發現200μmol·L－1的MPP＋會引起 p-Tau（Ser396）蛋白的水平升高，2 h、4 h水平逐步升高，在8 h時達到頂峰，然后隨著時間的延長反而降低。因此選擇MPP＋作用于SHSY5Y細胞8 h這個時間點，用酪氨酸羥化酶（TH）和p-Tau（Ser396）的熒光雙染進一步來證實，6-羥基-1H-吲唑對TH陽性細胞內Tau（Ser396）的磷酸化水平的影響。結果發現6-羥基-1H-吲唑可以明顯地降低TH-陽性細胞內Tau（Ser396）的磷酸化，從而對MPP＋誘導凋亡的SH-SY5Y細胞具有保護作用。

綜上所述，MPP＋誘導細胞凋亡伴隨著Tau的過磷酸化，而6-羥基-1H-吲唑可明顯對抗MPP＋的神經毒作用，并且抑制了Tau磷酸化。這提示：通過藥物干擾改變Tau蛋白的磷酸化水平可能是治療PD的一種新策略，而6-羥基-1H-吲唑可以發揮這樣的作用。我們計劃繼續研究6-羥基-1H-吲唑抑制Tau磷酸化的機制，并且通過用MPTP注射動物來制造PD動物模型，觀察6-羥基-1H-吲唑是否能夠降低MPTP對黑質多巴胺能神經元的損耗，并且改善行為學的損傷，由此進一步證明，6-羥基-1H-吲唑是一個可以通過調節Tau蛋白的代謝來達到治療效果的化學物質。

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