慢性低氧大鼠TRPC1表達與肺動脈收縮變化時間曲線關系

穆云萍，焦海霞，朱壯麗，戴 耄，黃秋虹，王瑞幸，林默君

（福建醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，心血管科學研究室，福建福州 350108）

肺高壓（pulmonary hypertension，PH）是指由異源性疾病和不同發病機制引起的以肺血管阻力進行性增加為主要特點的臨床病理生理綜合征［1］。典型的病理改變是血管張力增加、血管重塑和原位血栓形成，最終演化為危及生命的右心衰，是嚴重的慢性肺循環疾病［2］?，F已證實，在慢性低氧（chronic hypoxia，CH）致 PH大鼠，其肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）內升高的Ca2＋濃度介導肺血管阻力進行性增加與PASMCs增生，是低氧性肺高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）致病的關鍵因素［3］。而PASMCs上鈣池操縱性 Ca2＋通道（store-operated calcium channels，SOCC）與細胞內Ca2＋穩態的維持密切相關［4］。經典瞬時感受器電位（canonical transient receptor potential，TRPC）家族編碼的通道蛋白是SOCC的結構基礎［5］，SOCC可被 Ca2＋池耗竭劑環匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）激活，引起Ca2＋池操縱性 Ca2＋內流（store-operated calcium entry，SOCE）［3，6］，參與平滑肌細胞生長或血管重塑等病理改變。前期工作表明，HPH大鼠模型 PASMCs上，TRPC1表達上調，它所介導的SOCE和血管收縮張力都明顯增強［7］，提示，由于上調的 TRPC導致SOCE所介導的肺動脈（pulmonary arteris，PAs）收縮增強，可能是HPH發生的重要原因。因此本研究利用 HPH大鼠模型，分別檢測低氧 1、3、5、7、14、21 d等不同時間點，TRPC1表達與SOCE介導PAs收縮變化，通過比較兩者時間上的相互關系，進一步闡明TRPC1／SOCE的上調，在PH發病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 CH肺高壓模型的建立 清潔級♂ SD大鼠（200～220克），購自福建醫科大學實驗動物中心［SCXK（閩）2012－0001］，隨機分為慢性低氧0d組（NOR組）、1、3、5、7、14、21 d組，各組大鼠同時放于密封的有機玻璃飼養箱內，飼養箱內氧分壓調至9.5% ～10.5%。

1.2 右心室內壓測定 各組大鼠，用20%烏拉坦（0.5 g·kg－1）腹腔麻醉并進行肝素化處理，迅速經右頸外靜脈行右心室插管術，記錄大鼠平均右心室收縮壓（mRVSP）。

1.3 右心室重量指數測定 右心室插管操作完成后，迅速取出大鼠的心、肺組織，用眼科剪沿房室交界剪去全部的左右心房及大血管，僅保留兩側心室，沿室間隔分離出右心室（RV），濾紙吸干后用分析天平稱重，同法稱取左心室與室間隔（LV＋S）重量，計算 RVMI＝RV／（LV＋S）。

1.4 半定量RT-PCR檢測TRPC1的 m RNA表達水平 測完右心室內壓后，迅速取出肺葉，體視顯微鏡下分離出肺小動脈，縱向剪開，棉簽去除內皮。在液氮中將標本充分研磨后，加 TRIzol試劑提取RNA，用紫外分光光度法測定RNA的濃度及純度。按試劑盒的說明書進行RT-PCR。擴增條件：94℃2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，68℃ 45 s，30個循環。引物序列：TRPC1上游引物5′-ATGGGACAGATGTTACAAGATTTTGGG-3′；下游引物 5′-AGCA-AACTTCCATTCTTTATCCTCATG-3′，擴增片段長度為402 bp。β-actin上游引物 5′-GGTGTGATGGTGGGTATGGGT-3′；下游引物 5′-CTGGG-TCATCTT-TTCACGGT-3′，擴增片段長度為240 bp。利用Genetool軟件計算目的基因和內參（β-actin）條帶的平均灰度值，以目的條帶和β-actin的比值衡量各組目的基因表達的相對量。

1.5 肺動脈血管張力檢測 測完右心室內壓，取出肺葉，體視顯微鏡下分離出肺小動脈，剪成約3～5 mm的肺動脈環，去內皮后置于四腔浴槽中，給以1 g負荷，在RM6240多道生理記錄儀（成都儀器廠）上描記張力曲線，平衡2 h。實驗前先給予60 mmol·L－1KCl收縮血管，判斷血管環是否具有活性。然后，加苯腎上腺素（phenylephedrine，PHEN，終濃度0.1μmol·L－1）預收縮達最大反應，再加乙酰膽堿（acetylcholine，ACh，10μmol·L－1），觀察血管的舒張效應，以此來驗證血管環去內皮情況［8］。血管環活性及去內皮度驗證完畢后，觀察環匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA，Sigma公司）對不同低氧時間點PAs的收縮效應，CPA誘發PAs的收縮作用以60 mmol·L－1KCl收縮效應的百分數來標準化。

1.6 統計學分析 數據以ˉx±s表示，組間差異比較用one-way ANOVA方差分析，用Sigma Plot 11.0軟件繪制曲線。

2 結果

2.1 慢性低氧上調mRVSP和RVM I CH誘發PH大鼠模型的過程中，分別在 0、1、3、5、7、14、21 d七個時間點檢測大鼠的mRVSP和RVMI，并對其變化做時間依賴性曲線（Fig 1）。如圖所示，RVSP在慢性低氧1 d就明顯升高，7 d達到峰值（9.8±0.37）kPa，14 d后略有下降，直至21 d維持在 NOR組（4.0±0.16）kPa的兩倍水平左右（9.7±0.66）kPa。但是，體循環動脈壓和心率均沒有差別［9］，表明慢性低氧僅能夠使右心室內壓／肺動脈壓增高。RVMI低氧3 d開始增加，一直維持增加狀態，并未出現平臺期，表明慢性低氧3 d后就開始發生右心重構，右心室肥大。的收縮效應約為NOR組的1.5倍（P＜0.01），低氧5 d時收縮效應達最大值（90.2% ±15.1%，P＜0.01），隨后繼續維持在較高水平，直至低氧21 d收縮效應仍較NOR組有明顯增強，約為NOR組的2倍（87.2% ±7.1%，P＜0.01），低氧增強 PAs血管環收縮效應的變化與TRPC1 mRNA表達量變化的時間曲線趨于一致，提示在低氧初期 TRPC1與SOCC介導的PAs的收縮效應即明顯增強。

Fig 1 CH up-regulatesm RVSP and RVM IAverage values ofmRVSP at various time points after CH-induced（A，n＝10 for each time point）；average values of RVMIat various time points after CH-induced（B，n＝10 for each time point）**P＜0.01 vs control.

Fig 2 Time curve of expression of TRPC1 in PAsThe timetable ofmRNA expression of TRPC1（A）.Semi-quantitative RT-PCR analysis of TRPC1 mRNA expression in PAs usingβ-actin as internal standard（n＝3，**P＜0.01）.The time-dependent curve of TRPC1′s expression on CH rats（B）

Fig 3 Time curve of vascular tone of PAsmediated by SOCETime course of change in CPA-induced PA contraction in CH-treated rats（A）.The time-dependent curve of CPA（10μmol·L－1）response on CH rats（B），**P＜0.01 vs CON.

3 討論

臨床PH的發生常繼發于慢性阻塞性肺病等呼吸系統疾患，低氧是形成PH的重要因素，所以闡明HPH的發病機制一直是PH的研究熱點。在低氧環境下，血管對活性物質的反應可明顯增強，呈現慢性痙攣和過度肌化狀態，導致低氧性肺血管收縮（hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV）。一定水平的HPV是機體為適應氧分壓的降低而采取的一種保護措施，能夠維持低氧肺泡區內適當的通氣血流比值，起到通氣代償作用。但持續的HPV會引起肺循環外周阻力增加，最終形成HPH［10］。

本研究發現，RVMI在低氧3 d開始增加，隨時間延長呈增高趨勢，并且在低氧21 d內沒有出現平臺期；而RVSP在低氧1 d就明顯升高，低氧7 d即達到峰值，并且在低氧21 d時維持在NOR組的兩倍水平。以上結果提示持續低氧3 d即發生肺血管病理性改變，低氧7 d由于HPV加劇，導致肺血管重構，形成HPH，并隨低氧時間延長建立穩定的PH模型。

先前的研究表明在慢性HPH大鼠，PASMCs上TRPC1表達與SOCE功能明顯增高，升高的SOCE使PAs的收縮緊張度明顯增強［7］。為了探討TRPC1與SOCE功能的增強是否參與了HPH的發生和發展過程，本研究進一步檢測了低氧不同時間TRPC1表達和PAs收縮變化的時間曲線。結果顯示TRPC1 mRNA表達在低氧1 d即明顯增加，低氧3 d時達最高水平，低氧21 d保持為NOR組的2倍。而低氧3 d時PAs的收縮效應開始較NOR組有所增強，至低氧5 d時收縮效應達到最大值，隨后維持在較高水平，至低氧21 d時收縮效應也為NOR組的2倍。從結果中可以看到，低氧增強的PAs血管環收縮效應與TRPC1 mRNA表達變化，在時間上稍有延遲卻又保持相同趨勢。該結果提示TRPC1表達增強導致SOCE上揚，而后者又是介導PAs收縮增強的首要因素，最終引起HPH發生。

TRPC通道作為一類新發現的Ca2＋通道，自其發現以來，就被認為與SOCE密切相關。研究表明，TRPC參與構成功能性SOCC，其介導產生SOCE調節細胞質與細胞器之間的Ca2＋水平，TRPC過表達或表達下調直接影響SOCE水平［11］，這與本研究觀察到的兩者在低氧不同時間點變化的同步性一致。在眾多的TRPC通道中，TRPC1主要的功能為參與受體介導的Ca2＋依賴的分泌和收縮過程。TRPC1是PASMCs以及體循環細胞中SOCE的主要成分［12］，過表達大鼠PAs中的TRPC1會增強SOCE介導的血管收縮［13］。在增生的人PASMCs上，TRPC1表達與SOCE功能增強，經TRPC1反義寡核甘酸處理后，SOCE受到抑制。siRNA敲低大鼠PASMCs中的TRPC1會使thapsigargin激活的SOCE減弱，這些研究都提示TRPC1直接介導SOCE［3］。而本研究的實驗結果也顯示，在發生HPH的過程中，PASMCs上TRPC1 mRNA表達升高在前，隨即由SOCE介導的PAs收縮增強，而持續的肺血管收縮引起RVSP升高，到CH的21 d時，形成了穩定的PH模型。

綜上所述，本工作通過記錄HPH模型建立的21 d內 RVSP、RVMI、TRPC1 mRNA以及 PAs收縮張力變化的時間曲線，明確了TRPC1表達上調與SOCE功能增強之間的關系，其在PH發生發展過程中的關鍵作用。

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