牡荊素減輕小鼠潰瘍性結腸炎的藥效作用及機制研究

孫阿寧，任改艷，鄧 超，張晶晶，王崢濤，竇 薇

（1.中國藥科大學生藥學研究室，江蘇 南京 210038；2.上海中醫藥大學中藥研究所中藥標準化教育部重點實驗室暨上海市復方中藥重點實驗室，上海 201203）

潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis，UC）又稱慢性非特異性潰瘍性結腸炎，是一種病因尚未明確的慢性炎癥性腸病，以直腸和結腸黏膜與黏膜下炎癥為病變主要特征。臨床上本病以腹瀉、黏液膿血便、腹痛和體質量減輕等為主要癥狀，并有惡變的危險。流行病學顯示，近年來東西方UC患病率呈持續上升的趨勢［1］。臨床治療UC的傳統藥物包括：氨基水楊酸類、糖皮質激素類藥物、免疫抑制劑、抗生素類等，新興的生物制劑如英夫利西單抗（infliximab，IFX）、阿達木單抗（adalimumab，ADA）等療效明顯，但副作用多，難以長期用藥，尋找新的藥物和靶點仍然是UC治療的研究熱點［2］。

牡荊素（vitexin）主要存在于薔薇科植物山楂（Crataeguspinnatifida）中，是其干燥成熟果實中提取的總黃酮的主要有效成分之一。此外，也廣泛存在于其他植物中，如金蓮花、木豆葉、柳豆葉、淡竹葉、葎草等。牡荊素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降壓和解痙等多方面的生物活性［3］。近年來有研究報道牡荊素的抗炎作用［4］，但對其是否有減輕UC的藥效作用尚無報道。本研究評價牡荊素對UC小鼠模型的藥效作用，并通過檢測多種細胞因子的表達，進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 C57BL／6J♀小鼠，6～8周齡，體質量（20±2）g，SPF級環境飼養，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（滬）2009-0069。

1.1.2 藥物與試劑 牡荊素（C21H20O10，MW432.38）購于成都曼斯特生物科技有限公司（純度≥98%，編號A0358）；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulosesodium，CMC）購于國藥集團有限公司，批號：F20110915；DSS購于美國MPBiomedicals公司；MPO檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；TRIzol購于LifeTechnologies公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；引物序列根據基因庫中序列設計，由上海賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠潰瘍性結腸炎模型的建立、分組及給藥

小鼠按體重隨機分為3組，分別為正常對照組（Vehicle）、模型組（4%DSS）及牡荊素組（4%DSS＋Vitexin，50 mg·kg－1，灌胃），每組10只。正常對照組小鼠自由飲用自來水，其他組小鼠采用課題組前期研究報道的潰瘍性結腸炎造模方法［5－6］，用雙蒸水將DSS配成4%（W／V）的溶液，小鼠自由飲用7 d制備UC模型。造模當天同時給藥，根據有關文獻牡荊素給藥劑量選為 50 mg·kg－1體質量［7］，溶于質量分數為0.5%CMC溶液，超聲溶解?？瞻捉M及模型組給予相同體積的0.5%CMC溶液。

1.2.2 標本采集和結腸病理損傷評分 實驗過程中觀察小鼠的行為活動、體重、大便性狀、腹瀉程度及死亡率，每天觀察并記錄。實驗結束后，頸椎脫臼法處死小鼠，立即剖取結腸，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，生理鹽水沖洗干凈。取4 cm用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理學變化并行病理損傷評分：炎癥細胞的滲出評分標準：0分，黏膜固有層內有極少量炎癥細胞；1分，黏膜固有層內有較多的炎癥細胞或黏膜固有層內的炎癥細胞增多；2分，炎癥細胞擴散至黏膜下層；3分，全層均有炎癥細胞滲出；組織損壞評分標準：0分，無黏膜損傷；1分，非連續的黏膜上皮損壞；2分，表層黏膜糜爛；3分，廣泛的黏膜破損并向腸壁深層擴展；將炎癥細胞的滲出和組織損壞評分相加即為組織病理損傷評分［8］。剩余結腸組織－80℃保存。

1.2.3 MPO活性檢測 采用ELISA方法檢測組織中MPO活性，取結腸組織50 mg，加生理鹽水制備10%勻漿液，4℃，10 000 r·min－1離心 15 min，取上清液，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 反轉錄熒光定量PCR 取結腸組織30 mg，用TRIzol試劑提取組織總RNA并定量。按TaKaRa逆轉錄試劑說明書，取1μg RNA逆轉錄制備cDNA。用ABI 7300熒光定量PCR儀以β-actin為內參照，引物序列如下：β-actin上游引物 5′-CAGCCT TCCTTCTTGGGTAT-3′，下游引物 5′-TGGCATAGAG GTCTTTACGG-3′；TNF-α上游引物 5′-CGTGGAACT GGCAGAAGAGG-3′，下游引物 5′-AGACAGAAGAG CGTGGTGGC-3′；IL-6上 游 引 物 5′-ACCACGGCCT TCCCTACTTC-3′，下 游 引 物 5′-CATTTCCACGA TTTCCCAGA-3′；COX-2上游引物 5′-GAAGTCTTTG GTCTGGTGCCT-3′，下游引物 5′-GCTCCTGCTTGAG TATGTCG-3′。操作按試劑盒說明書進行，反應條件：95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s變性，60℃ 34 s退火，40個循環。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件，實驗數據以±s表示，采用單向方差分析（One-way ANOVA）及LSD檢驗。

2 結果

2.1 病理進程和體重變化 造模開始后，和正常組相比，造模組小鼠出現反應遲緩，懶動，少食，毛色不光潔，嗜臥扎堆，拱背，體重明顯減輕，大便松散，稀便，血便，說明結腸出現不同程度的損傷和出血。牡荊素組小鼠上述癥狀輕于造模組，體重下降程度明顯低于造模組（Fig 1）。

Fig 1 Body weight changes after DSS induction of colitis（n＝10）＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs vehicle group；*P＜0.05 vs DSS group

2.2 結腸組織病理切片及評分 造模7 d后處死小鼠，打開腹腔，正常對照組結腸黏膜上皮完整，未見壞死剝脫，黏膜腺體結構清晰，黏膜下血管豐富。模型組小鼠可見結腸腸壁腫脹、充血，腸黏膜廣泛充血、水腫，局部有糜爛、出血，并可找到明顯的潰瘍灶，鏡下可見潰瘍病變主要限于結腸黏膜和黏膜下層，毛細血管擴張、充血、水腫，有大量的淋巴細胞、漿細胞、單核細胞和中性白細胞浸潤，并可見數量不等的嗜酸性粒細胞及點狀出血灶。牡荊素組潰瘍較少，并可見已愈合的潰瘍組織，組織水腫和充血明顯減輕，炎細胞浸潤明顯減少（Fig 2）。對結腸組織進行組織病理損傷評分，牡荊素組評分明顯低于造模組（P＜0.01）（Fig 3）。

2.3 結腸黏膜MPO活性 與正常組相比，模型組小鼠MPO活性明顯升高（P＜0.01），灌胃給予牡荊素后，結腸黏膜MPO活性明顯低于模型組（P＜0.05）（Tab 1）。表明牡荊素能明顯抑制結腸黏膜組織MPO活性。

2.4 結腸組織TNF-α、IL-6和COX-2 mRNA相對表達 與正常組相比，模型組小鼠結腸組織中COX-2和促炎因子 TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，牡荊素組小鼠 TNF-α、IL-6和COX-2水平明顯下降（P＜0.01）（Fig 4）。

Fig 2 Representative HE-stained colon sections（n＝6）A：magnification 40×；B：magnification 100×

Fig 3 Histopathological assessment of HE-stained colon sections（n＝6）＃＃P＜0.01 vs vehicle group；**P＜0.01 vs DSSgroup

Tab 1 MPO activity in colon mucosa±s，n＝6）

Tab 1 MPO activity in colon mucosa±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs vehicle group；*P＜0.05 vs DSS group

Group MPO／U·g－1 Vehicle 0.39±0.08 DSS 0.82±0.17＃＃DSS＋Vitexin 0.51±0.08*

Fig 4 Expression ofmRNA in colon of DSS-induced colitism ice（n＝3）＃＃P＜0.01 vs vehicle group；**P＜0.01 vs DSSgroup

3 討論

目前UC的病因和發病機制仍不十分明確，普遍認為是由多因素相互作用所致，主要包括環境、免疫、遺傳、精神等因素。免疫學研究表明，UC患者腸道上皮屏障破壞，黏膜通透性增加，腸組織長期暴露于大量抗原中，導致腸道免疫系統過度反應和錯誤識別，引起巨噬細胞和淋巴細胞的激活，釋放一系列細胞因子和炎癥介質，激活機體的免疫應答，炎癥反應逐級放大，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間的平衡失調，導致組織損傷［9－11］。

化學誘導劑DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型，其病理改變與人類UC相似，而且制作簡便、經濟、易于復制，適合進行作用機制探討和藥物療效比較［6，12］。研究證明，2% ～5%的 DSS誘導急性結腸炎模型，造模周期4～9 d［13］。本研究應用DSS成功復制了小鼠UC模型。造模組小鼠出現腹瀉、便血以及結腸黏膜潰瘍，并且檢測到MPO活性升高，TNF-α、IL-6和COX-2水平升高。牡荊素可明顯減輕DSS誘導的小鼠體重下降，改善結腸損傷程度，抑制MPO活性，降低TNF-α、IL-6和COX-2水平。

MPO是中性粒細胞含量較高的一種酶，其活性反映了中性粒細胞的浸潤數目和活性，已被公認為評價炎癥嚴重程度的一個指標。對于它的檢測能較好地反映本病急性炎癥期中性粒細胞浸潤情況，凡是存在中性粒細胞浸潤的組織都可以通過MPO活性測定來判斷細胞浸潤程度［14］。本研究表明，牡荊素治療后，MPO活性明顯下降，說明牡荊素可以抑制中性粒細胞的浸潤，從而減輕UC炎癥程度。

環氧合酶2（COX-2）是前列腺素（prostaglandin，PG）合成過程中一種重要的限速酶。正常結腸黏膜不表達COX-2，炎癥黏膜上皮細胞及結腸固有層單核炎性細胞表達COX-2，能催化形成炎癥介質前列腺素樣物質（主要為PGE2），PGE2具有擴血管、增加腸黏膜通透性和刺激腸上皮細胞分泌的作用，從而擴大炎癥反應［15－16］。本實驗研究表明，牡荊素組結腸組織COX-2 mRNA表達水平明顯低于模型組，從而降低結腸黏膜組織的炎癥反應。

TNF-α由激活的單核巨噬細胞產生，在炎癥反應中促使其他細胞因子釋放，形成細胞因子網絡，擴大炎癥連鎖反應。IL-6由活化的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，能刺激巨噬細胞或單核細胞、淋巴細胞等合成前列腺素、細胞因子、血小板激活因子等炎性介質，是一種作用廣泛的促炎細胞因子。UC患者血清及腸黏膜組織中TNF-α、IL-6水平升高，近年TNF-α單抗在治療UC取得一定效果［17］。本研究顯示牡荊素可以降低TNF-α、IL-6 mRNA水平，說明牡荊素減緩UC炎癥反應可能是通過抑制炎癥因子的分泌水平。

本研究首次報道牡荊素對DSS誘導的小鼠UC有明顯的改善作用，其作用機制可能與抑制MPO活性和抑制炎癥因子的分泌有關。本文可以為進一步探討牡荊素的UC治療藥理機制和UC藥物開發提供依據。

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