無創肢體缺血預適應對心肌缺血／再灌注損傷內皮功能的影響

陳偉佳，劉東明，強兆艷，溫 克，袁恒杰，康 毅，婁建石，吳艷娜

（天津醫科大學1.藥理學教研室、2.基礎醫學院，天津 300070；3.天津醫科大學總醫院藥劑科，天津 300052）

肢體缺血預適應（limb ischemic preconditioning，LIPC）是指肢體經歷的反復短時間缺血／再灌注（ischemia-reperfusion，I／R）可增強心臟等其他器官對隨后長時間I／R損傷的耐受性。與傳統的心臟原位預適應比較，LIPC更為方便可行，顯示出強大的臨床應用價值。盡管有臨床研究表明LIPC的心血管保護效應，其機制尚不清楚。

心肌I／R在損傷心肌細胞的同時也破壞了血管內皮功能。一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮素（endothelin，ET）-1均為內皮衍生的血管活性物質，其生成、釋放及彼此之間的負反饋調節對維持體循環穩定有重要作用［1－2］。二者的比值（NO／ET-1）是反映內皮功能的重要指標。

微小 RNAs（microRNAs，miR）是一類由20～24個核苷酸構成的、高度保守的、非編碼蛋白的單鏈小分子RNA。它可通過促進靶mRNA的降解，引起基因沉默，或抑制其翻譯過程，在轉錄后水平調節靶基因表達，進而參與多種生理及病理生理過程。研究表明，多種miR在心肌I／R損傷中具有重要的調節作用［3］。作為針對心肌I／R損傷的內源性防治方法，LIPC很有可能通過調節心臟miR表達變化而構建心臟防御表型，使其獲得對I／R損傷的耐受能力，但目前尚未見文獻報道。

本文在前期研究［4－5］的基礎上，檢測 LIPC對心肌細胞凋亡、血清 NO、ET-1水平及心肌組織 mir-30a-3p表達的影響，并利用 ATP敏感性鉀通道（ATP-sensitive potassium channel，KATP）抑制劑5羥基癸酸鈉（5-Hydroxydecanoate，5-HD）進一步探討LIPC的心血管保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康♂ Wistar大鼠82只，體質量232～268 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 材料 5-HD（BioMol，美國）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（上海靈錦精細化工有限公司）；兔抗FasL多克隆抗體（Santa Cruz，美國）；兔抗Fas多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；原位細胞凋亡檢測試劑盒（Roche，德國）；大鼠內皮素-1酶聯免疫吸附測試盒（Adlitteram Diagnostic Laboratories，美國）；一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所）；焦碳酸二乙酯（Sigma，德國）；M-MLV逆轉錄酶、TRIzol RNA分離試劑、dNTP（Invitrogen，美國）；DNA Marker DL500、SYBR?Premix Ex TaqTMII（TaKaRa，日本）；mir-30a-3p和U6的逆轉錄引物及上下游引物（英濰捷基上海濰易有限公司）；HX-300動物呼吸機、BL-420E生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；GS-15R型低溫高速離心機（Beckman，美國）；2050型自動石蠟切片機（Leica，德國）；勻漿機（BioPulverizerTM，美國）；UV-240型紫外分光光度計（Shimadzu，日本）；BIO-RAD IQ5熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國）等。

1.3 實驗模型的建立

1.3.1 心肌I／R損傷模型 參考本室前期研究中的模型制備方法［4－5］。大鼠以烏拉坦（1 g·kg－1）腹腔注射麻醉。開胸后暴露心臟。以左冠狀靜脈為標識，3×10號縫合針穿000號絲線，在左心耳下緣水平進針，經左冠狀動脈前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）下，肺動脈圓錐旁出針。將一末端為球形的聚乙烯小管穿過絲線兩端形成活結，拉緊活結導致LAD供血區心肌缺血，放松活結使缺血心肌得到再灌注。大鼠經歷LAD缺血30 min，繼之再灌注2 h，即為心肌I／R損傷模型。

1.3.2 LIPC模型 參考本室前期研究的模型制備方法［4－5］。大鼠以戊巴比妥鈉（30 mg·kg－1）腹腔注射麻醉，將改良的無創血壓測定儀套管置于大鼠左后肢根部，脈搏傳感器置于足背動脈搏動最明顯處。加壓，以脈搏波消失作為股動脈被阻斷的標志，持續5 min；減壓，以脈搏波重新出現作為恢復血流灌注的標志，持續5 min，為1個循環，每天反復3個循環。連續預處理3 d。

1.4 LIPC功能檢測實驗動物分組

1.4.1 I／R組（n＝14） 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg·kg－1），連續 3 d。d 4，LAD行 30 min缺血／2 h再灌注。缺血前10 min股靜脈注射與藥物等體積的生理鹽水（normal saline，NS），并于 I／R期間恒速靜脈輸入與藥物等體積的NS。

1.4.2 I／R＋LIPC組（n＝14） 大鼠每天經歷3次左后肢5 min缺血／5 min再灌注，連續3 d。余同I／R組。

1.4.3 I／R＋5-HD組（n＝14） 大鼠于 d 4缺血前10 min股靜脈注射5-HD溶液9 mg·kg－1。并于I／R期間泵恒速靜脈輸入5-HD溶液1 mg·kg－1。余同 I／R組。

1.4.4 I／R＋LIPC＋5-HD組（n＝14） 大鼠于 d 4缺血前10 min股靜脈注射5-HD溶液9 mg·kg－1。并于I／R期間泵恒速靜脈輸入5-HD溶液1 mg·kg－1。余同 I／R＋LIPC組。

1.5 心肌組織m iR-30a-3p表達檢測實驗動物分組

1.5.1 正常對照組（sham，n＝6） 大鼠連續 3 d腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg·kg－1）。d 4，LAD下穿線后曠置150 min。

1.5.2 I／R組（n＝6） 大鼠于 d 4 LAD經歷 30 min缺血／2 h再灌注，余同sham組。

1.5.3 LIPC組（n＝6） LIPC模型大鼠于 d 4，LAD下穿線后曠置150 min。

1.6 觀察指標

1.6.1 血壓和心率 于LAD缺血前，缺血立即、15、30 min，再灌注30 min及2 h等時間點，以BL-420E生物機能實驗系統記錄心率、收縮壓和舒張壓，計算平均動脈壓。

1.6.2 心肌梗死范圍 參考本室前期研究中的模型制備方法［4－5］。于再灌注2 h末結扎 LAD，股靜脈注射質量濃度為6 g·L－1的臺盼藍2 ml。迅速剪下心臟，生理鹽水中洗凈殘血和染料，于－20℃凍存20 min。從心尖部向心基底部將心肌組織切成1 mm厚的切片，將不著色的危險區（area at risk，AAR）心肌組織置于避光的質量濃度為10 g·L－1的TTC溶液中，37℃孵育20 min。瀕死區心肌組織由于有還原活性的琥珀酸脫氫酶而被染為磚紅色，梗死區（infarct size，IS）心肌組織由于琥珀酸脫氫酶活性消失，不能被染色而顯示為灰白色。用體積分數為0.1的福爾馬林溶液固定心肌標本，將灰白色的IS從磚紅色的AAR中分離出來，電子天平稱重，計算IS與AAR重量的百分比（IS／AAR%）。

1.6.3 心肌細胞凋亡 于再灌注2 h末迅速剪下心臟，生理鹽水中洗凈殘血。將近心尖部的1／3心肌組織置于體積分數為0.1的福爾馬林溶液中固定。心肌組織切片常規脫蠟水化，以脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測細胞凋亡，按試劑盒說明書操作。正常心肌細胞核被染為藍色，凋亡陽性心肌細胞核被染為棕黃色。每張切片計數5個無重疊高倍鏡視野（400×）下的總細胞核數和凋亡陽性細胞核數，各取其平均值。心肌細胞凋亡指數（apoptotic index，AI）被定義為凋亡陽性細胞數與細胞總數之比，以百分數表示。

1.6.4 心肌細胞凋亡相關蛋白Fas、FasL表達 上述心肌組織石蠟切片，Fas、FasL免疫組化染色按試劑盒說明書進行。以胞質或胞膜染成棕黃色為陽性表達細胞。在每張切片的陽性表達區域選擇5個無重疊高倍鏡視野（400×），計數其中的細胞總數及Fas或FasL的陽性表達細胞數。心肌組織Fas或FasL蛋白陽性指數（positive index，PI）被定義為陽性細胞數與視野中所有細胞總數之比，以百分數表示。

1.6.5 血清NO、ET-1含量 分別于 LAD結扎前和再灌注末從股靜脈取血，按試劑盒說明書操作，硝酸還原酶法測定血清NO含量，ELISA方法測定血清ET-1含量。

1.6.6 心肌組織mir-30a-3p的表達 各組動物均于實驗結束后取左室前壁心肌組織。TRIzol提取心肌組織總RNA，逆轉錄得到cDNA后，進行實時定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）反應。mir-30a-3p的逆轉錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACGCTGCAAA-3′，上游引物 5′-GATGCGC TTTCAGTCGGATG-3′，下游引物 5′-CAGTGCAGGGT CCGAGGT-3′，內參 U6逆轉錄引物 5′-AAAATATG GAACGCTTCACGAATTTG-3′，上游引物 5′-CTCGCT TCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物 5′-ACGCTTC ACGAATTTGCGTGTC-3′。反應參數設置：預孵育95℃ 3 min；擴增95℃ 3 s，60℃ 20 s，72℃ 1 s，循環40次；熔解曲線55℃30 s。所得數據用2－ΔΔCt公式校正后用來評定各樣本間的差異。

1.7 統計學處理 計量資料以ˉx±s表示，均數間多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。使用SPSS 11.5統計軟件分析處理。

2 結果

2.1 血壓和心率 缺血后，各組的平均動脈壓和心率均呈下降趨勢，再灌注后均有所回升，但仍低于缺血前水平，組間各時間點差異均無顯著性。

2.2 心肌梗死范圍 各組間AAR差異無顯著性（I／R：220.2 mg±45.8 mg；I／R＋LIPC：208.7 mg±39.6 mg；I／R＋5-HD：204.6 mg±34.0 mg；I／R＋LIPC＋5-HD：190.8 mg±17.3 mg），但與 I／R組比較，I／R＋LIPC組 IS／AAR比值明顯降低 （P＜0.05）。此作用被5-HD取消。I／R組與 I／R＋5-HD組之間差異無顯著性（Fig 1）。

Fig 1 Infarct size after ischem ia and reperfusion（n＝8）*P＜0.05 vs I／R group；＃P＜0.05 vs I／R＋LIPC group

2.3 心肌細胞凋亡 I／R＋LIPC組心肌細胞AI明顯低于 I／R、I／R＋5-HD和 I／R＋LIPC＋5-HD組（P＜0.01）。I／R組與I／R＋5-HD組之間差異無顯著性（Fig 2）。

2.4 心肌細胞凋亡相關蛋白Fas、FasL表達 與I／R組比較，I／R＋LIPC明顯降低心肌組織Fas、FasL陽性細胞百分比（P＜0.01）。此作用被5-HD取消。I／R組與I／R＋5-HD組之間差異無顯著性（Fig 3）。

2.5 血清NO、ET-1含量 LAD結扎前，與 I／R組比較，I／R＋LIPC組和 I／R＋LIPC＋5-HD組血清NO水平升高（P＜0.05）；ET-1水平有降低趨勢，但差 異無顯著性；NO／ET-1比值升高（P＜0.05）。再灌注2 h末，I／R＋LIPC組血清NO水平、NO／ET-1比值明顯高于I／R組，ET-1水平明顯低于I／R組（P＜0.05）。此作用被5-HD取消。I／R組與 I／R＋5-HD組之間差異無顯著性（Fig 4）。

2.6 心肌組織m ir-30a-3p的表達 與sham組比較，I／R組mir-30a-3p表達增加，而LIPC組表達減少（P＜0.01，Fig 5）。

Fig 2 Apotosis ofm yocardial cells after ischem ia and reperfusion（TUNEL，400×，n＝6）**P＜0.01 vs I／R group；＃＃P＜0.01 vs I／R＋LIPC group.

Fig 3 Expression of Fas and FasL in themyocardium after ischem ia and reperfusionA：Immunohistochemistry（400×）；B：Positive index（n＝6）**P＜0.01 vs I／R group；＃＃P＜0.01 vs I／R＋LIPC group

Fig 4 Concentrations of NO（A）and ET-1（B）in serum and NO／ET-1 ratio（C）before ischem ia and after ischem ia and reperfusion（n＝8）*P＜0.05，**P＜0.01 vs I／R group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs I／R＋LIPC group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs I／R＋5-HD group

3 討論

本研究結果顯示，LIPC明顯縮小心肌梗死范圍，減少心肌細胞凋亡，降低凋亡相關蛋白Fas、FasL的陽性表達細胞數，維持I／R后血清NO／ET-1比值處于較高水平，提示LIPC具有抗心肌梗死、抗凋亡、改善內皮功能等心血管保護作用。

LIPC改善內皮功能的確切機制尚不清楚。有研究表明，I／R誘導大量ET-1和超氧陰離子的生成，進而導致內皮功能障礙［6］。ET-1受體阻斷劑和氧自由基清除劑可減輕內皮損傷。Duda等［7］發現，I／R損傷心臟生成的ET-1通過線粒體復合物II刺激過氧化物的生成，后者激活血管還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，將黃嘌呤脫氫酶轉變為黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）。由XOD衍生的過氧化物介導內皮損傷。本實驗室前期研究表明，LIPC降低I／R損傷心臟的XOD活性和脂質過氧化物丙二醛含量［4］。本研究發現LIPC降低血清ET-1水平升高的幅度，提示LIPC可能通過減少I／R誘導的ET-1生成，降低XOD活性，減輕過氧化損傷，從而發揮心臟保護作用。

Fig 5 Expression ofm ir-30a-3p in myocardial tissueby qRT-PCR（n＝6）**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs I／R group

本研究中，LIPC的保護作用被KATP抑制劑5-HD取消，提示KATP的開放在LIPC誘導的心血管保護中具有重要作用。KATP存在兩種類型，分別位于細胞膜和線粒體上。5-HD曾被認為能夠特異性阻斷線粒體KATP，但有研究表明，它還可以阻斷細胞膜上的 KATP，并影響內源性脂肪酸的 β-氧化過程［8－9］。因此，5-HD可能通過阻斷細胞膜上或線粒體KATP的開放和影響心肌能量代謝而取消LIPC誘導的心血管保護作用。

已有大量研究報道，KATP的開放在LIPC誘導的縮小心肌梗死范圍和減少心肌細胞凋亡中發揮關鍵性作用［4，10］。本研究也再次證明了這一點。但KATP開放在LIPC改善血管內皮功能中的作用尚未見報道。生理狀態下，由于細胞內ATP的濃度處于正常水平，KATP可能不參與調控循環系統的基礎張力。但在I／R等病理情況或應激情況下，ATP濃度降低，可激活KATP，鉀離子外流增加，細胞膜超極化，抑制電壓依賴性鈣通道開放，降低細胞內游離鈣濃度。從而一方面抑制血管平滑肌收縮，降低外周血管阻力，改善心功能；另一方面，預防或減輕細胞內鈣超載，對細胞產生保護作用。有研究報道［11］，NO可激活KATP。而本研究中，與未做LIPC預處理的I／R組和 I／R＋5-HD組比較，I／R＋LIPC組和 I／R＋LIPC＋5-HD組缺血前血清NO水平升高，提示LIPC預處理可能通過增加NO的生成，開放KATP，進而在I／R損傷中發揮保護作用。亦有研究報道，KATP開放劑可減少血液和組織中的ET-1的含量，阻斷ET-1的作用［12－13］。本研究中，I／R前接受 LIPC處理的大鼠血清ET-1含量有降低趨勢，可能與LIPC程序激活KATP后減少ET-1生成有關。應用5-HD后，LIPC維持NO／ET-1之間平衡的作用被取消，亦可能與KATP被阻斷有關。

研究表明，多種miR參與內皮細胞功能和血管生成的調節［14］。Volkmann等［15］發現，轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導 miR-30a-3p表達明顯下調，后者通過甲基CpG結合蛋白2介導TGF-β對血管功能和內皮血管生成功能的損傷作用。本研究發現，相對于正常心肌組織中mir-30a-3p的表達量，心肌I／R損傷可使其表達增加，而LIPC可使其表達減少。鑒于I／R的損傷作用和LIPC的保護作用，mir-30a-3p在I／R組和LIPC組表達水平的截然相反的變化趨勢，提示其可能在LIPC的心血管保護中發揮重要的調節作用。

綜上，LIPC可減輕心肌I／R損傷，改善內皮功能，其心血管保護作用可能與開放KATP、調節血中NO與ET-1之間的平衡、減少心肌組織mir-30a-3p表達有關。

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