長時間甲醛固定的大鼠視網膜組織胰蛋白酶消化方法探討

李 琳，李彥林，周云豐，王麗麗，李志強，葛爭艷，郭宇潔，金 龍，任 燁，許 揚

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100093；2.中國中醫科學院西苑醫院實驗研究中心，北京 100091）

糖尿病大鼠視網膜病變研究中，采用胰蛋白酶消化視網膜是視網膜鋪片技術中關鍵的一環。目前，國內外文獻中報道的胰蛋白酶視網膜消化方法主要是針對短時間固定的組織，以4%甲醛或Carson’s固定液固定 24～48 h后進行胰酶消化［1－4］。但由于實驗研究中常因操作技術和實驗安排等原因，視網膜組織長時間固定的情況也較多見。筆者在糖尿病大鼠眼球病理學研究中發現，采用常規條件消化長時間固定的視網膜，消化效果比較差，大量組織附著在視網膜血管周圍，無法獲取干凈的視網膜血管網進行鋪片、染色和相應的病理學研究。本實驗對不同時間甲醛固定的眼球視網膜組織，設計了不同的消化液濃度和消化時間，得到了完整清晰的視網膜消化鋪片效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，32只，♂，體質量180～220 g。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2012－0001］，飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級動物房內［許可證號：SYXK（京）2013－0023］，20℃，照明 12h晝夜交替，大鼠自由攝食和飲水。

1.1.2 主要試劑 PBS（Solarbio）；胰蛋白酶（1∶250，Amresco）；馬來酸（Sigma，M0375）；氫氧化鈉（北京益利精細化學品有限公司，20071105）；Tris（Amresco，AR0497）。

1.1.3 儀器 pH計（上海精密科學儀器有限公司，型號 PHS-25）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DHG-9140A）；脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號 TS-2000A）；Olympus正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號BX53）。Nikon多功能連續變焦顯微鏡（日本尼康公司，型號：AZ100）。

1.2 方法

1.2.1 動物處死及取材固定 正常大鼠32只，購入后適應性飼養1周。實驗時頸椎脫臼法處死，立即摘取眼球，4%甲醛溶液固定2 d、2周、1月、3月、5月和7月。

1.2.2 胰蛋白酶液的配制 分別取 1 mol·L－1馬來酸溶液 10 ml、1 mol·L－1Tris溶液 10 ml、0.5 mol·L－1NaOH溶液24 ml，加蒸餾水稀釋至100 ml，調節pH為7.8，配制Tris-Maleic稀釋液。用Tris-Maleic稀釋液分別配制3%、6%、9%胰蛋白酶，4℃保存。

1.2.3 視網膜鋪片的制備 分別將固定2 d、2周、4周、3月、5月、7月的眼球分離視網膜。自睫狀體后部近鋸齒緣剪開鞏膜，去掉眼前節和玻璃體，將眼后段平均分成3份，在PBS中輕輕分離視網膜。將視網膜在PBS中浸洗過夜，每個眼球的3份視網膜分別放在3%、6%、9%胰蛋白酶消化，將按照Fig 1的消化方法進行操作。

Fig 1 Protocol for retina digestion time and trypsin concentration in formalin fixed eye

分離好的視網膜組織胰蛋白酶消化液中，37℃恒溫箱孵育。孵育過程中，將視網膜移入PBS中，輕輕吹打，使殘余的視網膜神經成分及內界膜完全脫去。繼續消化直至視網膜消化完全。記錄不同固定時間的大鼠眼球組織的視網膜在3個濃度消化液中完全消化分別所需的時間。消化結束后，在蒸餾水中輕輕吹去視網膜血管網上黏附的細胞，平鋪在防脫載玻片上，自然干燥。行PAS染色，蘇木精復染，中性樹膠封片。在光鏡下攝取并記錄視網膜消化的狀況。實驗重復2次。

2 結果

2.1 眼球組織常規固定后視網膜消化鋪片 固定時間48 h，在37℃3%胰蛋白酶消化3.5 h，顯示視網膜消化完全，顯微鏡下可見清晰視網膜血管網，血管周細胞和內皮細胞核深染，并具有完整的輪廓（Fig 2）。

Fig 2 Retinal blood vessel of conventional fixed retina digested in 3%trypsin（A：×100，B：×400）

2.2 大鼠眼球組織固定2周及1月后視網膜消化鋪片 對于甲醛固定2周及1月的大鼠眼球，按照“2.1”的方法進行消化，通過實際摸索，消化時間需要延長，固定2周的大鼠眼球分離的視網膜組織以消化9 h為最適宜時間，而固定1月的大鼠眼球分離的視網膜組織則需要延長至14 h。實驗結果表明，不改變胰蛋白酶的濃度，僅延長胰蛋白酶的消化時間，仍得到了常規固定時間同樣的實驗結果（Fig 3）。

2.3 大鼠眼球組織固定3月后視網膜消化鋪片固定3月后的大鼠眼球分離的視網膜組織，用3%胰蛋白酶消化時，每2 h通過肉眼及光學顯微鏡觀察，消化至22 h時，視網膜組織完全消化（Fig 4A）。胰蛋白酶濃度增加至6%，延長消化時間至20 h，視網膜組織達到完全消化的程度（Fig 4C）。而胰蛋白酶濃度增加至9%，視網膜組織同樣需要經過20 h達到完全消化的程度（Fig 4E）。3%、6%與9%的胰蛋白酶均能將視網膜組織充分消化，提示固定3月的大鼠眼球的視網膜消化適宜胰蛋白酶消化濃度為3%，消化時間為22 h。提高胰蛋白酶濃度對于縮短視網膜消化時間的影響不大。

2.4 大鼠眼球組織固定5月后視網膜消化鋪片采用3%胰蛋白酶消化固定5月后的大鼠眼球分離的視網膜組織，消化至24 h時，視網膜組織可大部分消化，但仍有部分組織存在（Fig 5A）。延長消化時間，血管周圍殘余的非血管組織仍然存在，且隨著消化時間的延長，視網膜血管容易出現斷裂而得不到完整的視網膜血管網。將胰蛋白酶的濃度分別增加至6%和9%，隨著消化時間延長，消化的程度明顯增加，且達到完全消化的程度均需要經過22 h（Fig 5C，5E）。6%與9%的胰蛋白酶濃度對視網膜組織均能達到充分消化的程度，提示固定5月的大鼠眼球視網膜組織的適宜胰蛋白酶消化濃度為6%，消化時間為22 h。

Fig 3 Retinal blood vessel of 2 week-fixed and 1month-fixed retina digested in 3%trypsin（A，C：×100，B，D：×400）A，B：fixed for 2 weeks；C，D：fixed for 1 month

Fig 4 Retinal blood vessel of 3 month-fixed retina digested in 3%，6%，9%trypsin（A，C，E：×100，B，D，F：×400）

Fig 5 Retinal blood vessel of 5 month-fixed retina digested in 3%，6%，9%trypsin（A，C，E：×100，B，D，F：×400）

2.5 大鼠眼球組織固定7月后視網膜消化鋪片采用同樣的方法對固定7月后的大鼠眼球視網膜組織進行消化，3%胰蛋白酶消化至30 h時，視網膜組織上存在部分非血管組織（Fig 6A），且由于消化時間的延長，視網膜血管容易出現斷裂而明顯影響視網膜血管網的完整性。將胰蛋白酶的濃度分別增加至6%和9%，消化時間延長至28 h，視網膜組織均可以達到完全消化的程度（Fig 6C，6E）。6%與9%的胰蛋白酶濃度對視網膜組織的消化均能達到充分的程度，提示固定7月的大鼠眼球視網膜組織的適宜胰蛋白酶消化濃度為6%，消化時間為28 h。

3 討論

視網膜血管鋪片技術是研究視網膜血管病變的一種重要技術。要制作良好的視網膜血管鋪片，需要對視網膜組織進行充分的胰蛋白酶消化。長期以來，視網膜組織胰蛋白酶消化的方法都是按照1960年Kuwabara等［1］創立的方法進行。通過視網膜血管鋪片技術，可以清晰觀察到視網膜微血管的清晰結構及細胞狀態，以及病理狀態下的微血管增生、血管內皮細胞丟失等改變［2－3，5－6］。但是在對糖尿病視網膜病變的研究中，筆者發現對于長時間固定的大鼠眼球，分離視網膜組織后，常規濃度的胰蛋白酶消化液和常規消化時間均無法使視網膜消化完全。

Fig 6 Retinal blood vessel of 7 month-fixed retina digested in 3%，6%，9%trypsin（A，C，E：×100，B，D，F：×400）

視網膜血管由于其特殊的物質組成，對胰蛋白酶具有抵抗，因此胰蛋白酶不能消化視網膜血管［7］。在胰蛋白酶消化視網膜過程中，胰蛋白酶通過水解細胞間結合處蛋白，將細胞分開，使視網膜神經成分和內界膜脫離血管網，得到完整的視網膜血管層。胰酶分散細胞的活性與其濃度、溫度和作用時間有關。研究中我們發現，隨著視網膜組織固定時間的延長，消化難度逐漸增大。因為甲醛在常溫時能自動聚合為三聚甲醛，而醛基對蛋白質形成廣泛的交聯作用［8］。短時間固定，胰蛋白酶可以打開蛋白質間交聯；長時間固定，蛋白質間緊密交聯，因此需要通過提高胰蛋白酶濃度、延長消化時間，增加胰酶分散細胞的活性。

本研究首先采用常規濃度胰蛋白酶，對常規固定眼球的視網膜組織進行消化，消化時間為3.5h得到完整視網膜血管網，與文獻報道［3，5，9］的消化時間一致。在此基礎上，我們摸索了較短時間固定的眼球視網膜組織的最佳消化條件，發現對于甲醛固定2周及1月的大鼠眼球，采用常規胰蛋白酶濃度（3%），僅延長胰蛋白酶的消化時間至9 h及14 h，可以達到與常規固定24～48 h同樣的消化效果。在上述實驗基礎上，筆者進一步摸索了更長時間固定的眼球視網膜組織的最佳消化條件。研究結果表明，對于固定3月的大鼠眼球，采用常規濃度的胰蛋白酶僅延長消化時間至22 h，同樣可以得到完整的視網膜血管鋪片，且提高胰蛋白酶濃度對于縮短視網膜消化時間的影響不大。而對于固定5～7月的大鼠眼球，隨著消化時間的延長，視網膜血管容易出現斷裂，這可能是消化過度而造成了血管細胞的損傷。當胰蛋白酶濃度提高到6%和9%時，固定5月及7月視網膜消化的時間延長至22 h和28 h，則可得到相對消化完整的視網膜血管。

過度的胰酶濃度可造成組織細胞的損傷，在本研究中也得到了證實。因此，在實驗過程中，掌握合適的胰酶濃度和消化的時間顯得尤為重要。對于甲醛固定的組織，隨著固定時間延長，醛基對蛋白質形成的交聯被牢固封閉，蛋白酶無法使長期被掩蓋的抗原決定簇重新暴露［8］，然而針對這種抗原遮蔽可以采用抗原修復的方法來解除部分交聯，減輕對免疫組化染色造成的影響［10］。同時有文獻報道［11］，腦組織在固定液中長時間浸泡，對于其超微結構的電鏡檢查造成的影響是微不足道的。我們的實驗結果表明，固定達7月眼球組織的視網膜經過適當濃度和時間進行胰酶消化，可得到和短時間固定的眼球組織相同的清晰形態學結構，對于研究受試物對視網膜的病理形態學影響具有明顯的實用價值。而視網膜的亞細胞結構的病理學研究、視網膜組織的超微結構是否能夠得到理想的結果，還需要進一步深入研究。

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