昆明山海棠內生真菌ThF-11化學成分抗菌殺線蟲作用的研究

鄭 喜，李國紅，王 芯，祁 燕，萬春平

（1.云南中醫學院第一附屬醫院中心實驗室，云南 昆明 650021；2.云南大學云南省生物資源保護與利用重點實驗室，云南 昆明 650021）

植物內生菌是一種新的微生物資源，它能影響藥用植物活性成分的產生和積累，因此通過植物內生真菌獲取活性物質是一條有效的途徑。國內、外對昆明山海棠的研究主要集中在化學成分及免疫抑制、抗腫瘤活性的研究，但對其內生真菌以及抑菌、殺線蟲研究較少［1－4］。本研究基于“藥用植物－內生菌－活性成分”的研究思路，以昆明山海棠內生真菌為研究對象，通過內生真菌代謝產物化學成分分離與抑菌、殺蟲效應有機結合的研究，從中發現具有活性的代謝產物，以期對昆明山海棠資源二次開發和生態環境平衡產生積極意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Bruker DRX-500型核磁共振儀；Bruker Avance III-600 NMR型超導核磁共振儀；Finnigan LCQ-Advantage型質譜儀；薄層層析用硅膠板和柱層析硅膠G（200-300目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（Amersham Pharmacia公司）。分離所用的有機溶劑均為重蒸的工業純試劑。

1.2 供試菌株、病原菌、線蟲 菌株ThF-11分離于昆明山海棠；大腸桿菌Escherichia coli、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa均保藏于云南省生物資源保護與利用重點實驗室菌種庫。以秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans作為供試線蟲。

1.3 實驗用培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB）（馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g，蒸餾水定容至1 000 ml，pH值自然）；LB培養基（NaCl 10 g、Tryptone 10 g、Yeast Extract 5 g，去離子水定容至 1 000 ml，pH 7.0）；燕麥片培養基（燕麥片 20 g，蒸餾水 80 ml）。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 DNA的提取［5］將真菌 ThF-11菌絲（0.5～1 g）在液氮中迅速研磨成粉；加入500μl 65℃預熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻，65℃水浴30 min，期間混勻2～3次；加入50μl5 mol·L－1KAc，冰浴20 min；用酚（pH 8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶異戊醇（24∶1）各抽提1次（10 000 r·min－1，4℃離心5 min）；取上清，加入 2／3倍體積的－20℃預冷異丙醇，混勻，靜置約30 min；用毛細玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復漂洗2次，10 000 r·min－1，4℃離心 15 min，棄上清，吹干沉淀，重懸于500μl TE buffer中；加入1μl RNaseA（20 g·L－1），37℃處理 1 h，－20℃保存備用。DNA提取緩沖液：100 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），1.5 mol·L－1NaCl，2%CTAB（W／V），4%PVP40（W／V）和 2%巰基乙醇（V／V），PVP和巰基乙醇使用前加入5 mol·L－1KAc。

1.4.2 ITS系列擴增

真菌 ITS擴增通用引物：ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′）。

1.4.3 PCR擴增產物純化回收和測序 PCR結束后，進行濃度2% 的瓊脂糖凝膠電泳，同時以5μl的DNA maker作為標準參照，130V，15 min。然后用Biotake的DNA純化回收試劑盒，按說明書要求對擴增產物進行純化回收。檢測后的目的DNA片段的樣品，送華大基因測序。

1.5 提取與分離 菌株ThF-11發酵8 L，減壓濃縮至500 m l，發酵液經正丁醇萃取、濃縮合并得粗提物10.8 g，粗提物過大孔樹脂，分別用去離子水（3 L）、30%乙醇（5 L）、60%乙醇（5 L）、95%乙醇（5 L）依次洗脫，得6個組分 A1～A6。A1～A2（2.56 g）甲醇溶解，拌樣，過硅膠柱，石油醚－丙酮系統（40∶1，30∶1，20∶1；V／V）梯度洗脫，再利用 Sephedex LH-20甲醇凝膠進一步純化得到化合物［1］；將A3（1.14 g）過凝膠柱，甲醇洗脫，得到 3個組分（A3.1～A3.3），然后將 A3.3（0.686 g）等量硅膠拌樣，自然風干過硅膠柱，石油醚－丙酮系統（25∶1，20∶1，15∶1；V／V）梯度洗脫，再經 Sephedex LH-20丙酮凝膠進一步純化得到化合物［2］；將A4～A5合并的B組分（2.44 g）過凝膠柱，甲醇洗脫，得2個組分B1～B2，再將B1（0.565 g）過凝膠柱，甲醇洗脫，得到3個組分（B1.1～B1.3），將 B1.2（0.427 g）等量硅膠拌樣，自然風干過硅膠柱，石油醚－丙酮系統（40∶1，30∶1，20∶1，15∶1，10∶1；V／V）梯度洗脫，得到化合物［3］。

1.6 殺線蟲活性的測定 線蟲培養于燕麥片培養基，使用時洗出配成線蟲懸液（2×105條·L－1），取0.9 ml線蟲懸液于16孔板中，加入0.1 ml相應濃度（1 000、800、600、400、200 mg·L－1）的化合物，對照組加入等體積的甲醇，混勻后放于28℃溫箱，每一處理重復3次。在解剖鏡下隨機選擇3個視野定時（12、24、36、48 h）觀察，如線蟲僵直，針刺無反應視為死亡，記下觀察到的死線蟲數。線蟲的校正死亡率用以下公式計算：

其中，M（mortality）表示線蟲校正死亡率，Nt表示實驗組的總線蟲數，Nts表示實驗組存活線蟲數，Nc對照組的總線蟲數，Ncs為對照組存活線蟲數。通過校正致死率計算出化合物對線蟲的致死中濃度LC50。

1.7 抑菌活性的測定 以病原菌S.aureus、B.subtilis、B.scereus、E.Coli和P.aeruginosa為供試菌株，采用抑菌圈法［6］和試管法［7］測定化合物抑菌活性。抑菌圈法測試濃度分別為 800、400、200μg·disc－1，等量甲醇作為對照。37℃培養12 h觀察、測量抑菌圈的直徑（含濾紙片的直徑6 mm），每個抑菌圈在垂直方向上測兩次取平均值，抑菌圈直徑大小表示抑菌效果；同時用二倍梯度稀釋法分別進行平板（500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5、3.906 25 mg·L－1）和試管（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 mg·L－1）測試化合物［1］和［3］對五種細菌的最低抑菌濃度，綜合評價化合物的抑菌效果。

2 結果

2.1 菌株分子生物學鑒定結果 用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進行擴增，對擴增產物純化回收和測序，并進行ITS比對，與簡青霉Penicillium Simplicissimum相似度達98%，因此鑒定該菌株為簡青霉。

2.2 化合物結構 運用1H-NMR、13C-NMR、MS等分析方法，對化合物［1］－［3］進行結構鑒定，結構見Fig 1。

Fig 1 Chem ical structures of［1］-［3］

化合物［1］：無色晶體；1H-NMR（CDCl3，600 MHz）：1.74（s，CH3），3.89（s，OCH3），5.10（s，H-2），5.17（s，H-6），5.45（s，H-6）；13CNMR （CDCl3，150 MHz）：17.6 （Me），60.2（OCH3），89.5（C-2），103.2（C-4），116.5（C-6），139.6（C-5），171.6（C-1），179.4（C-3）.ESI-MS：171［M＋H］＋與文獻數據［8］一致，因而鑒定該化合物結構為Penicillic acid。

化合物［2］：白色粉末；1H-NMR（CDCl3，500 M Hz）：2.25（3H，s，CH3-6），3.76（3H，s，OCH3-4），3.86（3H，s，OCH3-2），6.30（1H，d，J＝2.7 Hz，H-3），6.36（1H，d，J＝2.7 Hz，H-5）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）：153.1（C-4），147.1（C-2），138.3（C-2），124.2（C-1），107.0（C-5），97.2（C-3），56.4（C-2），56.2 16.1（C-4），ESIMS：189［M＋H］＋與文獻數據［9］一致，鑒定該化合物結構為 2，4-dimethoxy-6-methylphenol。

化合物［3］：無色晶體；1H-NMR（CDCl3，500 M Hz）：0.68（3H，d，J＝6.9 Hz，CH3-7），2.49（1H，m，H-5），3.49（1H，d，J＝10.0 Hz，H-6b），3.75（1H，t，J＝ 10.0 Hz，H-6a），3.87（3H，s，OCH3-3），5.09（1H，s，H-2）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：178.8（C-3），171.7（C-1），106.8（C-4），89.9（C-2），65.5（C-6），60.1（OCH3-3），38.0（C-5），11.4（C-7），ESI-MS：189［M＋H］＋與文獻數據［10］一致，因此確定其結構為5（6）-dihydropenicillic acid。

2.3 殺線蟲活性結果 殺蟲活性測試表明，化合物［2］和［3］無殺蟲活性，化合物［1］具有較強的殺蟲作用，在12、24、36和48 h化合物對秀麗隱桿線蟲C.elegans的 LC50分別為 1 325.25、829.39、611.26、453.40 mg·L－1，呈現良好的量效和時效關系，結果見Tab 1。

Tab 1 Corrected morbidity（%）of compound 1 on C.elegans

Tab 2 M inimal inhibitory concentration（M IC，p late assay）of compound 1 and 3 on the grow th of five bacteria

Tab 3 M inimal inhibitory concentration（M IC，tubemethod）of compound 1 and 3 on the grow th of five bacteria

2.4 抑菌活性結果 采用最低抑菌濃度值法（MIC，平板法和試管法）評估化合物［1］和［3］對5種病原菌的抑菌活性。Tab 2、3結果顯示，化合物［1］對5種病原菌均表現出較強的抑菌活性，其抑菌效果明顯強于化合物［3］，且具有較好的量效關系。試管法的抑菌效價比平板法高，這可能與藥物對病原菌作用速度及時間有關［11］。

3 討論

昆明山海棠［Tripterygiumhypoglaucum（Levl.）Hutch，THH］為衛矛科雷公藤屬植物，又名六方藤、紫金藤、火把花等，主要分布于我國西南地區。始載于《滇南本草》，具有祛風通絡、活血化淤的功效，為拉祜族、哈尼族、彝族等常用藥［12］。現代研究表明，昆明山海棠主要含有生物堿、萜類、色素類等多種成分，具有抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等多種藥理活性［1－4］。但對其內生真菌以及抑菌、殺線蟲研究較少［13］。

內生菌與宿主植物間的關系復雜，歸納為相互作用、互利共生。內生菌對宿主植物的作用主要有：調節植物生長、抗蟲害、抗菌性、抗逆性、促進植物次生代謝產物的合成等。植物內生菌存在于各種植物中，抗菌活性菌株分布廣泛，是抗菌物質的重要潛在來源，一方面，有些內生菌能夠分泌與宿主相同或相似的抗菌物質；再者，很多內生菌會產生新穎的活性物質［13］。據文獻報道［1］，昆明山海棠植物內無青霉酸（Penicillic acid），因此推測昆明山海棠內生真菌可能增強宿主植物產生抗蟲害和抗菌性，從而產生具有抗生素樣具有抑菌、抗蟲害的代謝產物。

植物病原線蟲是植物病害的主要病原之一，而且種類多樣，每年對世界農業生產帶來巨大的損失。隨著人們環保意識的增強，化學殺蟲劑的應用逐步受到限制，因此對線蟲防治研究成為焦點和重點。內生真菌普遍存在于植物體內，且能夠產生較多的生物活性物質［14］，因此從次級代謝物中尋找殺線蟲活性物質已成為新的研究熱點。本研究首次從昆明山海棠中分離內生菌株ThF-11，其代謝化合物［1］、［2］和［3］均首次從昆明山海棠內生真菌中獲得，所得化合物［1］表現出較強殺蟲活性。該研究進一步拓展了民族藥昆明山海棠應用價值，為其二次開發應用于醫藥和農業病害蟲的防治提供了理論依據和參考，對開發云南地產植物藥材，促進中藥資源的保護、生態環境的平衡、社會的可持續發展具有重要意義。目前有關代謝化合物［1］對于模式生物秀麗隱桿線蟲的作用機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

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