烏司他丁通過Nrf2／HO-1抗氧化途徑在OVA誘導的支氣管哮喘小鼠中發揮治療作用

宋冬梅，牛英豪，于 磊，王寶山

（河北醫科大學第一醫院耳鼻咽喉及變態反應科，河北石家莊 050031）

哮喘是一種氣道的慢性炎癥性疾病［1］，當前對該病的病因及發病機制尚未完全清楚。目前認為氧化應激在哮喘發病中起著重要作用，過度的ROS造成AHR、氣道炎癥，還可以導致膜脂質過氧化，引起多種生物大分子結構（如蛋白質、脂質、DNA）和功能的改變，導致氧化與抗氧化失衡［2］。因此調節細胞內氧化／抗氧化平衡在哮喘的治療中具有重要意義。

Nrf2／HO-1通路廣泛參與多種組織器官的抗氧化應激損傷，是機體內最重要的抗氧化應激機制之一。HO-1作為一種抗氧化酶在哮喘的治療中具有重要作用，研究證明誘導HO-1表達可以改善氣管炎癥、粘液分泌過多、氧化應激和高應答性［3－4］；Nrf2作為HO-1激活的主要的轉錄因子，在正常生理條件下，Nrf2與其抑制蛋白Keap1結合存在于細胞質中；在氧化應激等刺激下，Nrf2磷酸化與Keap1解離并易位到細胞核，再ARE結合，啟動HO-1基因的轉錄［5－6］，表現出明顯的抗氧化作用。

烏司他丁（UTI）是一種高效廣譜的水解酶抑制劑，臨床上廣泛應用于以中性粒細胞介導的感染中毒等炎性疾病的治療［7－9］，而變應性炎癥以介導嗜酸細胞、肥大細胞等為主，兩者的作用機制截然不同，因此，本文將深入探討UTI在變應性炎癥中抗氧化作用的藥理機制，為其轉化為治療變應性炎癥的輔助用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及材料 6～8周齡SPF級FVB小鼠（北京維通利華實驗動物技術公司），體質量（20±3）g。卵清蛋白（OVA）、β-actin抗體及雙氫羅丹明（DHR）-123試劑盒：美國 Sigma公司；HO-1及Nrf2抗體：美國Santa Cruz公司；LaminB抗體：美國Zymed公司；Nrf2（ARE）EMSA Kit：美國Signosis公司；TRIzol、SYBR-green-containing PCR kit：日 本TaKaRa公司；Reverse Transcription Kit：美國 Promega公司；Protein carbonyl content assay kit：美國 Abcam公司；小鼠 IL-4、IFN-γ及 IgE（ELISA）試劑盒：美國R＆D公司；SOD、GSH、TAOC及 MDA檢測試劑盒：南京建成生物公司；7500 Real Time System：美國Applied Biosystems；ECL發光試劑盒：南京凱基生物科技公司；電子轉膜儀：美國Bio-Rad公司；酶標儀：美國AI公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 實驗分為對照組（Con）、OVA致敏組（OVA）、地塞米松治療組（OVA＋Dex）、烏司他丁治療組（OVA＋UTI）、Znpp抑制劑組（OVA＋UTI＋Znpp），每組10只；烏司他丁劑量干預組和時間干預組每組5只。哮喘模型的建立［10］：于 d 0、9和 d 14腹腔注射 OVA［25μg／鼠OVA＋2.5 mg Al（OH）3凝膠，in 250μl PBS］進行基礎致敏，d 21～27用1%OVA氣道霧化進行激發。烏司他丁和地塞米松治療組小鼠在21～27 d腹腔注射 UTI（100 kU·kg－1·d－1）或 Dex（1 mg·kg－1·d－1）進行治療，Znpp抑制組小鼠在注射 UTI 1 h前腹腔注射 Znpp（20 mg·kg－1·d－1），對照組用PBS（pH 7.4）代替。在最后一次激發后的24 h后測定小鼠的氣道反應性，處死動物，取肺組織和支氣管肺泡灌洗液，備用。

1.2.2 小鼠氣道反應性的測定 末次激發后，采用AniRes2005動物肺功能分析系統測定小鼠的氣道反應性。1%戊巴比妥鈉60 mg·kg－1麻醉小鼠后行氣管插管，連接小動物呼吸機，通過測定小鼠氣道氣流和壓力變化，得出小鼠氣道阻力（Re）的變化。首先記錄Re的基礎值1 min；隨后測定倍增濃度的乙酰甲膽堿（Mch）霧化激發小鼠氣道后Re的變化，每次霧化1 min，記錄3 min。Mch激發濃度由低到高，依次為0、3、6、9和27 g·L－1，記錄數據，進行分析。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的采集 小鼠麻醉采完血液標本后，結扎左肺，右肺收集BALF，即以生理鹽水（1.5 ml·kg－1）經右主支氣管灌入，然后抽出，再次灌注與前次抽出量相等的生理鹽水，同法操作，共灌洗3次。灌洗液經雙層紗布濾過，4℃以3 000×g，離心15 min，取上清液－80℃保存。

1.2.4 肺組織的采集 打開胸腔，取左肺20 mg加入組織裂解液0.5 ml，于勻漿機中勻漿，裂解1 h后，分別提取漿、核及總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，－70℃保存。剩余左肺按與氣道橫斷面垂直方向修剪成3 mm厚的組織片，用OCT包埋備用。

1.2.5 小鼠BALF中細胞因子及總IgE和OVA特異性IgE的檢測 將保存在－80℃的BALF取出，冰上復融后4℃3 000×g離心10 min，使用ELISA法檢測小鼠BALF中IL-4、IFN-γ和IgE的水平，具體方法依照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.6 小鼠BALF細胞中ROS的檢測 用PBS洗BALF中的細胞并計數，使用雙氫羅丹明（DHR）-123試劑盒檢測小鼠BALF細胞中ROS水平，熒光強度（FITC）可代表ROS水平；具體方法依照試劑盒說明書進行。

1.2.7 小鼠肺組織中 Protein carbonyl content和MDA水平的檢測 分別使用檢測試劑盒檢測小鼠肺組織中Protein carbonyl content和MDA的水平，具體方法依照試劑盒說明書進行。

1.2.8 小鼠BALF中SOD、GSH和TAOC活性的檢測 將保存在－80℃的BALF取出，冰上復融后4℃3 000×g離心10 min，分別使用試劑盒檢測小鼠BALF中SOD、GSH和TAOC的水平，具體方法依照試劑盒說明書進行。

1.2.9 Western blot檢測肺組織蛋白中 HO-1及Nrf2的表達 提取肺組織的總蛋白、漿蛋白及核蛋白，將等量的蛋白（40μg）在10%的SDS／PAGE中以80 V恒定電壓電泳，直至指示劑遷移至凝膠下端的附近時，停止電泳。取下膠塊，切取目的條帶，30 V，0.09 A，低溫條件下進行轉膜并過夜。轉膜完畢后，將膜取出，在5%的脫脂奶粉封閉液，常溫震蕩封閉 2 h。分別孵育小鼠 HO-1，Nrf2，β-actin or laminB 4℃孵育過夜，將膜取出，在TBST中震蕩洗滌3次，每次10 min。洗膜后加入HRP標記的相應的二抗，常溫震蕩孵育1 h。將膜取出，在TBST中震蕩洗滌3次，每次20 min。使用ECL試劑曝光。底片經掃描儀掃描后，確定目的條帶的相對吸光度值。

1.2.10 Immunofluorescence（IF）staining檢測肺組織Nrf2的核轉移 將OCT包埋的肺組織進行冰凍切片（6μm）多聚甲醛固定、脫水；用Nrf2抗體4℃孵育過夜，孵育fluorescein isothiocyanate-conjugated二抗，用 4′，6 diamidino-2-phenylindole（DAPI）染核，熒光顯微鏡觀察。

1.2.11 EMSA檢測肺組織Nrf2的結合活性 提取小鼠肺組織核蛋白，用Nrf2（ARE）EMSA Kit檢測Nrf2 DNA結合活性，具體方法依照試劑盒說明書進行。

1.2.12 Real-time PCR檢測肺組織mRNA中HO-1的表達 用TRIzol法從小鼠肺組織中提取總RNA。一步法逆轉錄擴增，具體試驗方法依照 Reverse Transcription Kit說明書進行。

使用SYBR-green-containing PCR kit進行Realtime PCR，具體試驗方法依照SYBR-green-containing PCR Kit說明書進行；試驗所用HO-1引物：forward，5′-GAT AGA GCG CAA CAA GCA GAA-3′，reverse，5′-CAG TGA GGC CCA TAC CAG AAG-3′；試驗結果分析使用 2－△△Ct法。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，同組前后比較采用連續觀察資料的方差分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 小鼠氣道反應性變化 各組Re都有隨Mch升高而增加的趨勢（Fig 1），相對于Con組，OVA組在Mch濃度為3、6、9和27 g·L－1激發時 Re上升趨勢均差異有顯著性（P＜0.05）；而OVA＋UTI組在同等Mch濃度激發下明顯降低Re上升趨勢（P＜0.05）。

Fig 1 UTIsuppresses AHR*P＜0.05 vs Con；＃P＜0.05 vs OVA.

2.2 UTI抑制OVA致敏小鼠BALF中總IgE和OVA特異性IgE的表達 相對于Con組，OVA致敏組中總IgE和OVA特異性IgE表達水平都明顯增高（P＜0.05），而 OVA＋UTI組中總 IgE和 OVA特異性IgE表達水相對于OVA致敏組明顯降低（P＜0.05）（Fig 2）。

2.3 UTI抑制OVA誘導的Th1／Th2因子失衡Fig 3結果表明：相對于Con組，OVA組IL-4的表達水平明顯升高（P＜0.05），IFN-γ的表達水平明顯降低（P＜0.05）；而 OVA＋UTI組中 IL-4的表達水平明顯下降（P＜0.05），IFN-γ的表達水平明顯升高（P＜0.05）。

2.4 UTI抑制OVA誘導的氧化應激 Fig 4結果表明：相對于Con組，OVA組中小鼠BALF中ROS活性及肺組織中的Protein carbonyl含量和MDA明顯升高（P＜0.05，而小鼠 BALF中的抗氧化酶GSH、SOD及 TAOC的活性明顯降低（P＜0.05），OVA＋UTI組中ROS的活性、Protein carbonyl含量和MDA的水平明顯降低（P＜0.05）（Fig 4A、B、C）；GSH、SOD及TAOC的活性明顯升高（P＜0.05）（Fig 4D、E、F）。

Fig 4 UTI inhibits OVA sensitization and challenge-induced oxidative stressA：BALF reactive oxygen species（ROS）activity；B：BALFmalondialdehyde（MDA）level；C：lung tissue protein carbonyl content；D：BALF levels of total superoxide dismutase（SOD）activity；E：glutathione（GSH）；F：total antioxidant capacity（TAOC）*P＜0.05 vs Con；＃P＜0.05 vs OVA；△P＜0.05 vs OVA＋Dex.

2.5 UTI的治療作用被HO-1的抑制劑Znpp逆轉 為了驗證UTI的治療作用與HO-1的關系，我們加入了HO-1的特異性抑制劑Znpp進行檢測，結果表明：Znpp明顯逆轉了UTI對OVA誘導的Th1／Th2因子失衡及氧化／抗氧化失衡的調控作用（Fig 5 A、B、C、D）。

2.6 UTI在蛋白水平上誘導HO-1的表達且具有時間和劑量依賴性 以 UTI濃度：0、25、50、100、200（kU·kg－1·d－1）處理小鼠做 Western blot，結果表明：隨著UTI濃度的增大，HO-1的表達水平逐漸升高（Fig 6A）；以100 kU·kg－1·d－1濃度的 UTI處理小鼠分別在 d 0、10、12、14、16、18處死小鼠，取肺組織做Western blot，結果表明：隨著時間的延長，HO-1的表達水平逐漸升高（Fig 6B）；上述結果表明UTI可以明顯誘導HO-1的表達，并且具有劑量和時間依賴性（Fig 6）。

2.7 UTI誘導Nrf2的核轉移 在核蛋白中，相對于Con組和OVA組，UTI組中Nrf2的表達水平明顯升高；在漿蛋白中，相對于Con組和OVA組，UTI組中Nrf2的表達水平明顯降低；OVA＋UTI組的結果和UTI組相似（Fig 7A）。我們進一步用IF staining檢測Nrf2的轉移情況，結果表明：在Con組和OVA組中熒光主要分布在胞質中，而在OVA＋UTI組中熒光主要分布在胞核中（Fig 7B）。上述結果表明：UTI誘導Nrf2的核轉移。

2.8 UTI增強 Nrf2與 ARE的結合活性并上調HO-1在基因水平的表達 EMSA結果表明：相對于Con組和OVA組，UTI組明顯增強Nrf2與ARE的結合活性（Fig 8A）；QPCR結果表明：相對于Con組和OVA組，UTI組明顯提高HO-1在基因水平的表達（Fig8B）；OVA＋UTI組的結果和UTI組相似。綜合以上結果，UTI通過誘導Nrf2的核轉移，增強Nrf2與ARE的結合活性，提高HO-1在基因和蛋白水平的表達。

Fig 5 Inhibition of HO1 activity attenuates UTI’s anti-inflammatory and antioxidant activitiesA：BALF levelsof IL-4；B：BALF levelsof IFN-γ；C：BALF reactive oxygen species（ROS）activity；D：BALF levelsof total superoxide dismutase（SOD）acitvity.*P＜0.05 vs Con；＃P＜0.05 vs OVA；△P＜0.05 vs OVA＋UTI.

Fig 6 UTIstimulates basal HO1 protein expressionWestern blot photographs showed that UTIdose-and time-dependently increased basal HO-1 protein expression in control lungs（A and B）.*P＜0.05 vs Con.

Fig 7 UTI indicating Nrf2 nuclear translocationA：Western blot photographs showed thatUTIincreased nuclear and decreased cytoplasmic Nrf2 content；B：Representative immunofluorescence staining showed that UTIstimulated Nrf2 nuclear translocation.*P＜0.05 vs Con.Scale bar＝20μm

3 討論

氣道高反應性（AHR）是支氣管哮喘公認的基本特征之一［11］，AHR和哮喘的嚴重程度呈正相關，能否降低AHR是療效的重要指標。本研究結果表明：在同一Mch濃度下，UTI組激發的氣道阻力明顯低于OVA組，提示UTI可以降低哮喘小鼠的氣道反應性。Th1／Th2失衡在哮喘的發生中起關鍵作用，結果表明UTI可以降低哮喘小鼠BALF中IL-4的濃度，提高 IFN-γ的濃度，調節Th1／Th2失衡；同時，可以降低哮喘小鼠BALF中總IgE和OVA特異性IgE表達水平，以上結果進一步表明：UTI在OVA致敏的哮喘小鼠中具有治療作用。

Fig 8 UTIstimulates Nrf2 activity and up-regulates HO-1 mRNA expressionA：EMSA photograph showed that UTIstimulated Nfr2 DNA binding activity in lungs；B：Q-RT-PCR showed that UTIup-regulated HO-1 mRNA expression in lungs.*P＜0.05 vs Con.

之前的研究表明，UTI能明顯消除OVA誘導哮喘小鼠BALF中的ROS［12］；本次研究從脂質和蛋白水平氧化損傷角度深入驗證了哮喘小鼠肺組織出現了明顯的的氧化損傷，而UTI明顯降低哮喘小鼠肺組織羰基蛋白質含量和MDA含量，有效控制了脂質和蛋白質氧化損傷的產生；本實驗中GSH、SOD等防止脂質過氧化和蛋白氧化的抗氧化酶與對照組相比明顯減少，提示內源性抗氧化劑被明顯過度消耗；而UTI處理后，測得其BALF中GSH、SOD等含量明顯高于OVA組，說明UTI具有提升內源性抗氧化酶產生進而減輕氧化損傷的能力。據此研究結果表明，UTI一方面通過消除ROS、降低脂質過氧化和蛋白質氧化水平防止氧化損傷；另一方面通過提高內源性抗氧化酶的數量和活性調節抗氧化系統，由此調節氧化／抗氧化系統的平衡而對機體起到保護作用。

HO-1在應激條件下高表達表現出明顯的抗氧化作用［13］，UTI的抗氧化作用是否與HO-1有關，結合前期研究結果，與哮喘模型組相比，HO-1在UTI治療組呈現明顯高表達［12］，本文假設UTI的抗氧化作用可能通過誘導HO-1而產生。為了驗證這一假設我們首先檢測了小鼠肺組織HO-1表達與UTI的相關性；結果顯示單純UTI給藥后，小鼠肺組織HO-1蛋白表達呈現明顯時間和劑量依賴性，最高可達小鼠肺組織HO-1蛋白基礎表達水平的3倍以上，這表明UTI可能是HO-1的誘導劑；為了進一步明確UTI的抗氧化作用是通過誘導HO-1而實現的，我們加入HO-1的特異性抑制劑Znpp，它可以抑制HO-1的分泌和活化，結果顯示加入Znpp后UTI對Th2因子IL-4及氧化應激指標ROS的抑制作用被逆轉，對Th1因子IFN-γ及抗氧化酶SOD等的激活作用被減弱；以上數據明確地證明了UTI保護OVA誘導的氧化應激損傷作用主要是通過誘導HO-1而實現的。

Nrf2／HO-1通路在機體氧化損傷保護中發揮著重要作用，Nrf2的核移位是HO-1活化至關重要的因素，研究結果顯示，單純UTI組小鼠肺組織中Nrf2的核蛋白表達水平明顯增加，而Nrf2的漿蛋白表達水平明顯下調，這表明UTI可能誘導了Nrf2核轉移；免疫熒光染色試驗也印證了這一結果；進一步的EMSA檢測顯示，在UTI組中Nrf2的結合活性明顯高于OVA組；上述結果顯示UTI誘導了Nrf2入核以及活化；同時QPCR檢測到UTI組HO-1在mRNA的轉錄水平明顯高于OVA組。至此實驗結果證實，在OVA誘導的哮喘小鼠模型中，UTI通過增強HO-1蛋白表達而發揮的抗氧化損傷的保護作用，主要是通過激活Nrf2／ARE信號通路，提高HO-1mRNA的轉錄水平而實現的。

綜上所述，本實驗明確探討了UTI對哮喘小鼠的治療作用以及可能機制，為臨床拓展UTI的應用提供了初步的基礎實驗依據，具體信號轉導途徑會在后續研究中深入探討。

參考文獻：

［1］ 范曉云，汪 浩，徐 軻，等.糖皮質激素對哮喘大鼠肺組織IL-8表達的抑制作用［J］.中國藥理學通報，2013，29（2）：277－80.

［1］ Fan X Y，Wang H，Xu K，et al.Inhibitory effect of glucocorticoids on expression of IL-8 in lung tissue of asthmatic rat model［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：277－80.

［2］ Saalu L C.The incriminating role of reactive oxygen species in idiopathic male infertility：an evidence based evaluation［J］.Pak J BiolSci，2010，13（9）：413－22.

［3］ Ameredes B T，Otterbein LE，Kohut LK，etal.Low-dose carbon monoxide reduces airway hyperresponsiveness in mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，285（3）：1270－6.

［4］ Pae H O，Lee Y C，Chung H T.Heme oxygenase-1 and carbon monoxide：emerging therapeutic targets in inflammation and allergy［J］.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov，2008，2（3）：159－65.

［5］ Chun K S，Kundu J，Kundu JK，etal.Targeting Nrf2-Keap1 signaling for chemoprevention of skin carcinogenesis with bioactive phytochemicals［J］.Toxicol Lett，2014，229（1）：73－84.

［6］ Namani A，Li Y，Wang X J，etal.Modulation of NRF2 signaling pathway by nuclear receptors：Implications for cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843（9）：1875－85.

［7］ Leng Y X，Yang SG，Song Y H，etal.Ulinastatin for acute lung injury and acute respiratory distress syndrome：A systematic review and meta-analysis［J］.World JCrit CareMed，2014，3（1）：34－41.

［8］ Karnad D R，Bhadade R，Verma PK，etal.Intravenous administration of ulinastatin（human urinary trypsin inhibitor）in severe sepsis：a multicenter randomized controlled study［J］.Intensive Care Med，2014，40（6）：830－8.

［9］ Yu L，Luo Q，Fang H.Mechanism of ulinastatin protection against lung injury caused by lower limb ischemia-reperfusion［J］.Panminerva Med，2014，56（1）：49－55.

［10］沈華浩，王蘋莉.支氣管哮喘小鼠模型應用評價［J］.中華結核和呼吸雜志，2005，28（4）：284－6.

［10］Shen H H，Wang P L.Evaluation of amousemodel of bronchial asthma［J］.Chin J Tubercul Respir Dis，2005，28（4）：284－6.

［11］Bates JH，Maksym G N.Mechanical determinants of airways hyperresponsiveness［J］.Crit Rev Biomed Eng，2011，39（4）：281－96.

［12］宋冬梅，劉 剛，牛英豪，等.烏司他丁對支氣管哮喘小鼠氧化應激及血紅素加氧酶-1的影響［J］.中華結核和呼吸雜志，2013，36（3）：225－6.

［12］Song D M，Liu G，Niu Y H，etal.Anti-oxidative effectof Ulinastatin and potential role of heme oxygenase-1 in an ovalbumin-induced murine asthma model［J］.Chin J Tubercul Respir Dis，2013，36（3）：225－6.

［13］萬曉紅，王 雁，趙國良，等.轉導血紅素氧合酶-1蛋白減輕腦缺血／再灌注沙土鼠海馬神經元的損傷［J］.中國藥理學通報，2014，30（5）：628－32.

［13］Wan X H，Wang Y，Zhao G L，et al.Effect of transducted heme oxygenase-1 protein on rat brain ischemia reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30（5）：628－32.