內質網應激介導白藜蘆醇對心肌細胞肥大的保護作用

林 巖，肖 薇，金 莉，鄧志會，李 波，王國忠，劉吉成

（齊齊哈爾醫學院1.醫藥研究所、2.病理生理學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江中醫藥大學中西醫結合博士后流動站，黑龍江哈爾濱 150040）

心肌肥大是心肌長期過度負荷引起的一種適應性病理變化，是高血壓、心肌病、急性心肌梗死等許多心血管疾病共有的病理生理過程和獨立危險因素。因此，研究心肌肥大的發生發展以及如何逆轉心肌肥大，對心血管疾病的防治具有重要意義。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種在紅酒和葡萄中存在的多酚類化學物質，具有強大的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎癥等生物學特性［1］。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是在多種生理或病理條件下，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網聚集，損傷內質網的正常生理功能，通過一系列蛋白表達調控，不能恢復內質網穩態后導致的內質網穩態失衡［2］。目前對Res的心血管保護研究主要集中在抗氧化、抗損傷等方面［3］，關于Res對異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導心肌細胞肥大的保護作用及與ERS的關系研究甚少。本實驗采用乳鼠心肌細胞原代培養，觀察了白藜蘆醇對心肌細胞肥大中內質網應激因子GRP78和CHOP表達的影響，探討其心肌肥大的保護作用機制，為臨床藥物應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 取新生1～3 d Sprague-Dawley大鼠乳鼠共20只，♀♂不拘，由齊齊哈爾醫學院動物研究所提供。

1.2 藥品與試劑 白藜蘆醇、異丙腎上腺素、5-溴2-脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；DEME培養基、新生牛血清購自Gibco；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒購于南京建成生物工程研究所；GRP78一抗、CHOP一抗和 β-actin一抗（Santa Cruz公司），二抗（辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司）。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術公司。

2 方法

2.1 乳鼠心肌細胞原代培養 乳鼠無菌條件下開胸取心室肌，0.25%胰酶分次消化至單細胞懸液，離心，棄上清，用含20% 胎牛血清的DMEM培養基制成細胞懸液，CO2孵箱中差速貼壁90 min，吸取未貼壁的心肌細胞接種到培養板上，置入37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中繼續培養，細胞貼壁24 h后出現自發性同步搏動，于接種48 h后換正常培養基繼續培養。

2.2 實驗分組 培養的心肌細胞隨機分為4組：①正常對照組（control）：無血清DMEM培養液；② 異丙腎上腺素組（ISO）：無血清DMEM培養液加入ISO 1 μmol·L－1作用 48 h；③ 白藜蘆醇干預組（Res＋ISO）：分別向培養基中加入ISO 1μmol·L－1和 Res 50μmol·L－1作用 48 h；④ 白藜蘆醇對照組（Res）：向無血清DMEM培養液中加入Res 50μmol·L－1。2.3 細胞表面積測定 將細胞接種于6孔板中，24 h后爬片，分組處理后，體積分數為0.95的乙醇固定15 min后行HE染色。采用圖像分析系統（奧林巴斯BS53）測定心肌細胞表面積，隨機選取5個視野，每個視野測定5個細胞，取其平均值。

2.4 實時定量PCR檢測 ANP、GRP78和 CHOP基因表達 按照TRIzol試劑說明書提取心肌細胞總RNA，紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度和完整性。參照TaKaRa公司提供的實時定量SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit說明書，在2700型PCR System擴增儀上進行逆轉錄反應，反應參數為：反轉錄反應42℃15min，反轉錄酶失活反應95℃2 min。在AB I 7300熒光定量PCR儀上進行PCR反應。反應條件如下：預變性95℃，10 s。PCR反應95℃，變性 5 s，60℃ 退火 30 s，共 40個循環。由上海生工生物工程有限公司設計合成特異性引物用于定量檢測ANP、GRP78和CHOPmRNA的表達。ANP上游引物：5′-GGGAAGTCAACCCGTCTCA-3′，下游引物：5′-GGGCTCCAATCCTGTCAAT-3′；GRP78上 游 引 物：5′-CTCAAAGCACCACACCAGTC-3，下游引物：5′-ACCGCAAAGTCTACCCACAG-3′；CHOP上 游 引 物：5′-GGCAGCGACAGAGCCAAA-3′，下游引物：5′-CAGCTGGACACTGTCTCAAAGG-3′。同時采用 β-actin為內參照，mRNA的表達量用 2－ΔΔCt表示。

2.5 LDH和MDA漏出量測定 取各組培養液上清，分別按各自檢測試劑盒操作說明書步驟進行操作、檢測和計算LDH和MDA漏出量。

2.6 心肌細胞凋亡率檢測 細胞凋亡的檢測采用Annexin V／PI凋亡檢測試劑盒。細胞培養48 h后，PBS清洗，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI至細胞懸液中，輕輕搖勻，置冰浴中反應10 min，加入400μl預冷的binding buffer至樣品中，1 h內上機檢測（激發光488 nm；發射光578 nm），各組陽性細胞百分率用于表示細胞凋亡水平。

2.7 W estern blot檢測蛋白的表達 取各組心肌細胞，加裂解液，離心后吸取上清液，Bradford法測定蛋白質濃度。各組取30μg上樣，SDS-PAGE電泳，蛋白轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后分別加入一抗GRP78和CHOP多克隆抗體和β-actin單克隆抗體，濃度均為1∶500，4℃孵育過夜，相應二抗孵育1.5 h，濃度1∶5 000。化學發光ECL顯色。電泳成像系統定量掃描分析，結果以β-actin校正。

2.8 統計學處理 實驗數據均經SPSS15.0統計軟件處理，結果以ˉx±s表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩之間均數比較采用q檢驗。

3 結果

3.1 Res對心肌細胞肥大的影響 與正常對照組比較，ISO作用后心肌細胞表面積和心肌肥大標志基因ANPmRNA表達明顯增加，Res抑制了ISO誘導的心肌細胞表面積和ANP表達，兩組數據均有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。Res對照組對心肌細胞表面積和ANP基因表達無影響（Fig 1，2）。

Fig 1 Effect of resveratrol on cell surface area of primary cultured neonatal rat cardiomyocytes（ˉx±s，n＝6）＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs ISO group

Fig 2 Effect of resveratrol on mRNA expression of ANP of primary cultured neonatal rat cardiomyocytes±s，n＝5）＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs ISO group.

3.2 Res對細胞培養液LDH和MDA漏出量的影響 ISO組培養液中LDH和MDA漏出量均高于正常對照組 （P＜0.01），表明ISO可誘導心肌細胞損傷。白藜蘆醇干預后，LDH和MDA漏出量與ISO組比較明顯降低 （P＜0.01），表明白藜蘆醇對心肌細胞有保護作用（Tab 1）。

3.3 Res對心肌細胞凋亡的影響 Tab 1顯示，ISO組心肌細胞凋亡率明顯高于正常對照組 （P＜0.01）。與ISO組相比，Res干預組心肌細胞凋亡率降低 （P＜0.05），表明Res可以對抗ISO誘導的心肌細胞凋亡，Res對照組與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

Tab 1 Effect of resveratrol on content of LDH and MDA in culturemedium and value of cell apoptosis（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of resveratrol on content of LDH and MDA in culturemedium and value of cell apoptosis（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs control；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ISO

Group LDH／U·L－1 MDA／μmol·g－1 Pro Value of cell apoptosis／%Control 458.4±26.3 4.3±0.8 14.7±2.5 ISO 725.3±28.2＃＃ 8.6±1.1＃＃ 32.6±2.7＃＃Res＋ISO 507.9±29.3** 5.1±1.3** 19.5±3.2*Res 484.5±25.6 4.1±0.9 15.1±1.9

3.4 Res對GRP78和CHOP基因和蛋白表達的影響 實時定量PCR（Fig 3）與Western blot（Fig 4）結果顯示，ISO誘導心肌細胞肥大后GRP78和CHOP基因和蛋白表達均明顯高于正常對照組（P＜0.01，P＜0.05），白藜蘆醇干預后，抑制 GRP78和CHOP基因和蛋白表達水平，與ISO組比較，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig 3 Effect of resveratrol on gene expression of GRP78 and CHOP of primary cultured neonatal rat cardiom yocytes（±s，n＝5）＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs ISO group

4 討論

心肌肥大既是心力衰竭的重要代償方式，又是心力衰竭發生的病理生理基礎。心肌肥大時表現為心肌細胞體積增大，但無細胞分裂，常伴有胚胎基因的表達增多。臨床上已將分泌型蛋白質如ANP和BNP編碼基因表達的上調作為判斷心肌肥大的分子標志［4］。本實驗觀察到 ISO作用心肌細胞后，心肌細胞表面積增大，胚胎基因ANP表達增加，這些結果表明ISO可成功復制心肌肥大細胞模型。

Fig 4 Effect of resveratrol on protein expression of GRP78 and CHOP of primary cultured neonatal rat cardiom yocytes（xˉ±s，n＝5）＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ISO group.

本實驗從細胞水平觀察白藜蘆醇對心肌肥大的保護作用，研究結果顯示，ISO誘導心肌細胞肥大的同時伴有心肌細胞培養液中LDH和MDA含量增加，LDH和MDA是反映心肌損傷的重要生化指標，二者水平增加表明ISO誘導心肌細胞損傷嚴重。機制可能與ISO抑制心肌細胞葡萄糖的有氧氧化，氧自由基產生增多、膜脂質過氧化增強和心肌細胞鈣超載有關。白藜蘆醇干預后，心肌細胞表面積和ANP基因表達下降，同時LDH和MDA漏出量減少，說明白藜蘆醇抑制心肌細胞肥大的同時，可能通過抗氧化、清除自由基發揮對心肌細胞損傷的保護作用。

白藜蘆醇是一類廣泛存在于植物中的多酚化合物，在缺血／再灌注性心肌損傷、動脈粥樣硬化以及冠心病等方面對心血管系統具有明顯的保護作用。近年來，大量研究觀察了內質網應激在心力衰竭［5］、心室負荷增加所致心肌肥厚［6］、心肌缺血／再灌注損傷［7］、慢性心肌缺血［8］、藥物所致心肌損傷［9］、心臟停搏／復蘇［10］等多種心肌疾病進程中的作用，對其干預也成為心臟疾病治療的重要研究方向。但是，關于白藜蘆醇的心肌保護作用與內質網應激關系的研究較少。目前認為內質網應激主要涉及3個內質網跨膜效應蛋白：iron responsible element1（IRE1）、PKR like ER kinase（PERK）和 activating transcription factor6（ATF6）。正常情況下，這3種蛋白在內質網腔內都與GRP78結合而處于無活性狀態，內質網穩態失衡表現為大量未折疊蛋白聚集，由于GRP78與未折疊蛋白質具有更高的親和力，導致GRP78與PERK、ATF6、IRE1解離，由此促進蛋白質的正確折疊，并啟動上述內質網應激3條主要信號轉導通路，對細胞發揮保護作用。因此，GRP78被視為內質網穩態的感受器，是內質網應激發生的標志因子。然而，當ERS嚴重或持續得不到緩解，則通過內質網應激誘導的凋亡通路而觸發細胞死亡［11，2］。

本實驗觀察到與正常對照組比較，ISO組心肌細胞凋亡率明顯增加，GRP 78和CHOP基因和蛋白水平均上調，白藜蘆醇干預后降低了細胞凋亡率同時下調GRP78和CHOP的表達，表明白藜蘆醇對ISO誘導的細胞凋亡和過度的ERS反應有保護作用。心肌細胞凋亡是慢性壓力超負荷情況下，心肌肥大向心力衰竭轉變的可能機制之一。除了細胞內兩條經典的凋亡途徑即死亡受體活化和線粒體損傷途徑外，內質網應激啟動的凋亡途徑是近年發現的一種新的凋亡途徑，包括CHOP／GADD153基因的激活通路、JNK激活通路和 caspase-12激活通路［12］。GADD153／CHOP是內質網應激特異的轉錄因子，內質網應激反應時，通過啟動CHOP轉錄與表達，誘導細胞凋亡。因此，抑制CHOP的表達，有助于保護細胞對抗內質網應激引起的凋亡。

研究表明［13］，缺血／再灌注損傷能夠激活 ERS通路凋亡前體蛋白分子CHOP的表達，而通過抑制缺血后心肌細胞CHOP的表達，能夠明顯減少凋亡的百分率，從而減輕缺血／再灌注對心臟的損害。我們的結果提示ISO誘導心肌細胞肥大時，蛋白質合成增加造成持續、嚴重的內質網未折疊反應，影響新合成蛋白質的折疊和糖基化，從而啟動蛋白質質量控制機制，誘導內質網應激，GRP78和CHOP活化后通過介導相應信號通路引起心肌細胞凋亡。白藜蘆醇通過減輕ERS，抑制氧自由基，從而拮抗ISO誘導的心肌凋亡和肥大，實現其對心肌細胞肥大的保護作用。

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