丙泊酚對癲癇大鼠學習記憶及海馬TLR4表達的影響

宋 煒，蔡 鵬，杜 雷，王志達，許志強，張詠梅

（徐州醫學院麻醉學院，江蘇 徐州 221004）

癲癇是神經系統比較常見的疾病之一，在所有的癲癇患者中，約有30%～40%存在不同程度的認知功能損害以及學習記憶功能的減退［1－2］。患者常出現記憶障礙、智力下降、性格改變等。近年來，關于癲癇患者伴有認知損害的報道越來越多，多數學者的研究認為認知損害與抗癲癇藥的副作用有關。但也有部分研究表明抗癲癇劑對癲癇大鼠學習記憶有改善作用，所以其確切的影響機制尚未明確。丙泊酚是目前臨床最常用的靜脈全身麻醉藥物之一，具有起效迅速、蘇醒快且功能恢復完善等優點，因而普遍用于臨床麻醉誘導與維持。王丹等［3］用荷包牡丹堿證實γ-氨基丁酸（GABA）A受體介導了全麻藥丙泊酚、依托咪酯對成年小鼠的學習記憶損害作用，說明丙泊酚有產生記憶障礙的副作用。突觸的可塑性被認為是學習記憶的可能機制，海馬是哺乳動物邊緣系統的主要組成部分，是參與空間學習記憶的重要腦區。海馬含有大量谷氨酸能和GABA能神經元，因而推測丙泊酚對以海馬為基礎的空間學習記憶可能具有影響［4］。近年來研究表明，丙泊酚擾亂認知并阻斷感覺信息投射到大腦高級中樞，從而影響認知的形成，所以丙泊酚使大鼠學習記憶能力下降的影響已被普遍認可。苯巴比妥鈉是目前用來預防和治療癲癇發作的主要藥物，而丙泊酚也是目前臨床最常用的靜脈麻醉藥，其對于癲癇大鼠以及服用抗癲癇劑后癲癇大鼠學習記憶能力的影響還不明確。免疫炎癥反應在癲癇發生過程中起著重要作用，而 Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種重要的天然免疫受體。有研究表明，TLR4介導的信號通路能識別內源性配體，參與癲癇所致炎癥反應，其具體作用機制尚不完全清楚。本研究制備癲癇大鼠模型，觀察丙泊酚和苯巴比妥鈉對癲癇大鼠學習記憶的影響，為臨床上癲癇以及服用抗癲癇制劑后的癲癇患者是否適合用丙泊酚作為靜脈麻醉劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 生理鹽水、脂肪乳劑（濃度為20%）為貝朗醫療公司產品；丙泊酚為國瑞公司有限責任公司產品；苯巴比妥鈉為上海新亞公司產品；戊四唑為Aladdin公司產品。

1.2 儀器 Morris水迷宮為上海軟隆科技發展有限公司產品。

1.3 實驗動物及分組 大鼠36只，體質量200～250 g，由徐州醫學院動物實驗中心提供，♀♂不拘。實驗前1周，動物每天在12 h光照、12 h黑暗交替（8∶00～20∶00為光照時間）的房間內飼養，保持室溫20℃～25℃，自由飲水和攝食。隨機分為癲癇模型組（EP）、生理鹽水＋癲癇組（NS）、脂肪乳劑＋癲癇組（LE）、苯巴比妥鈉＋癲癇組（PB）、丙泊酚＋癲癇組（Prof）及丙泊酚與苯巴比妥鈉聯合用藥＋癲癇組，每組6只。

1.4 大鼠癲癇模型制備 大鼠癲癇模型的建立參照文獻［5］：大鼠每天腹腔注射1次亞驚厥劑量15 g·L－1戊四唑溶液（30 mg·kg－1），每天注射均在早上8∶00～10∶00進行，連續28 d。模型成功與否以其發作時的行為變化為主要依據，按Racine分級，0級：無任何反應；1級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等；2級：1級加節律性點頭；3級：2級加前肢陣攣；4級：3級加后肢站立；5級：4級加摔倒。達到4～5級的大鼠選用，未達到4級的淘汰［6］。苯巴比妥鈉＋癲癇組大鼠于每日注射戊四唑前0.5 h腹腔注射10%苯巴比妥鈉溶液（60 mg·kg－1）。丙泊酚＋癲癇組和聯合用藥＋癲癇組在d 1～5訓練前，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg－1作為誘導劑量，待翻正反射消失后，再腹腔追加50 mg·kg－1加深麻醉。在d 6的測試前不應用。丙泊酚組與聯合組均在大鼠翻正反射恢復后20 min開始訓練。

1.5 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮為直徑125 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫保持（26±1.0）℃。池壁上有象征四個象限的不同標志，在一個象限的正中離池壁33 cm處放一個9 cm、高28 cm的黑色平臺，平臺頂低于水面1.5 cm。訓練期間迷宮外參照物保持不變。Morris水迷宮測試大鼠對水迷宮的學習和記憶能力。訓練共進行5 d，1～5 d觀察大鼠的定位航行能力。訓練時分別以四個象限作為入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠爬到平臺所用時間（潛伏期），如大鼠在120 s內未找到平臺，則將其引至平臺并停留30 s，此時潛伏期記為120 s，不能游泳者去除。記錄各組動物潛伏期進行比較。d 6測定大鼠的空間探索能力。撤去水中的平臺，把大鼠從距原平臺最遠的象限投入水中，入水點與d 1～5訓練時的位置相同。記錄60 s內在隱藏平臺所在象限停留的時間。

1.6 TLR4蛋白檢測 海馬組織勻漿碾碎后，離心取上清液，按說明書采用酶聯吸附測定方法（ELISA）檢測海馬中TLR-4蛋白的含量。

1.7 統計學處理 數據均采用ˉx±s表示，用SPSS 13.0統計軟件進行數據檢驗，組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，各組多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-Keuls Comparison Test法檢驗。

2 結果

2.1 丙泊酚對癲癇大鼠定位航行能力的影響 各組大鼠d1潛伏期相比無明顯差別（P＞0.05）。癲癇模型組、生理鹽水＋癲癇組、脂肪乳劑＋癲癇組、苯巴比妥鈉＋癲癇組、聯合用藥＋癲癇組大鼠d 2潛伏期均開始縮短。d 3丙泊酚組大鼠較癲癇模型組和脂肪乳劑對照組大鼠潛伏期明顯延長，其他組間差異無顯著性。d 4和d 5，生理鹽水對照組與脂肪乳劑對照組相比，潛伏期差異無顯著性（P＞0.05）。丙泊酚組與癲癇模型組相比，潛伏期明顯延長；苯巴比妥鈉組與癲癇模型組相比，潛伏期差異無顯著性（P＞0.05）。聯合用藥組與丙泊酚組相比，潛伏期差異無顯著性（P＞0.05）；聯合用藥組與苯巴比妥鈉組相比，潛伏期明顯延長。見Fig 1，2。

Fig 1 Escape latency in training test*P＜0.05 vs EP；＃＃P＜0.05 vs LE

Fig 2 Escape latency in training test（d 5）*P＜0.05 vs EP；＃P＜0.05 vs combination

2.2 丙泊酚對癲癇大鼠空間探索能力的影響 d 6撤去平臺，觀察各組大鼠的空間探索能力。生理鹽水對照組（51.6±10.74）與脂肪乳劑對照組（52.3±6.78）對比，平臺停留期差異均無顯著性（P＞0.05）。丙泊酚組（38.9±3.45）與癲癇模型組（53.5±4.39）對比，平臺停留縮短；苯巴比妥鈉組（29.5±10.80）與癲癇模型組對比，平臺停留期縮短。聯合用藥組與丙泊酚組對比，平臺停留期縮短；聯合用藥組與苯巴比妥鈉組對比，平臺停留期縮短（Fig 3）。水迷宮軌跡圖顯示（Fig 4），各用藥組在平臺象限停留的時間以及穿梭次數均較癲癇模型組減少。

Fig 3 Time spent in quadrant 3 in probe test*P＜0.05 vs EP；＃P＜0.05 vs combination

2.3 丙泊酚對癲癇大鼠腦組織TLR4表達的影響與癲癇模型組相比，生理鹽水組、脂肪乳組的TLR4蛋白表達量均無明顯差異（P＞0.05）；苯巴比妥鈉組、丙泊酚組TLR4蛋白表達明顯增高（P＜0.05）。聯合用藥組與苯巴比妥鈉組和丙泊酚組相比，TLR4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見 Fig 5。

3 討論

本實驗研究表明，丙泊酚以及抗癲癇劑對癲癇大鼠的學習記憶能力有不同程度的損害，各用藥組TLR4的表達較癲癇模型組明顯增多，提示了TLR4可能參與了丙泊酚及抗癲癇劑對大鼠學習記憶障礙的發生與發展。

實驗中應用的Morris水迷宮是神經生物學研究動物空間學習、記憶功能常用的行為學檢測方法，能夠較準確地反映實驗動物以視覺為基礎的空間學習、記憶、定向及定位能力的變化［7］。實驗中，點燃大鼠在前5 d進行游泳尋航訓練，學會了找到固定位置隱蔽的平臺，并且記錄每一次找到平臺的時間和路程軌跡，從而可以檢驗點燃大鼠的學習能力。d 6撤去了平臺，檢測大鼠在原平臺位置所在象限停留時間，從而可以檢驗點燃大鼠的記憶能力。這樣從兩個方面來綜合評判點燃大鼠的認知能力，使結論更具說服性。丙泊酚是目前臨床最常用的靜脈全身麻醉藥物之一，但近來有文獻報道，用丙泊酚麻醉后的患者可發生學習、語言、判斷等認知功能異常［8－9］。實驗發現，聯合應用苯巴比妥鈉、丙泊酚的癲癇大鼠相比其他各組大鼠，潛伏期明顯延長，說明聯合應用的藥物造成大鼠腦神經元不可逆性的損傷，其學習能力受明顯抑制，記憶能力明顯減退，聯合應用藥物對神經元損害程度最大。

癲癇對大鼠的學習記憶損害機制并未明了。以往的研究中發現，反復癲癇發作可以導致海馬結構發生病理變化，包括海馬神經元的變性壞死、突觸間隙異常增寬及突觸后膜的密度改變、海馬異常苔蘚樣發芽以及由此導致的突觸聯系異常，與學習記憶聯系緊密的NMDA受體表達分布異常、信號轉導通路異常等［10］。

TLR4是一種重要的天然免疫受體，它可以介導受損或應激產生的內源性配體，引發炎癥反應。近年來研究顯示，大腦內的免疫炎癥反應參與了癲癇發作引起的腦損傷過程，癲癇發作后，腦組織存在的炎癥反應提高了神經元的興奮性，損傷存活的細胞，增加血腦屏障的通透性［11］。Maroso等［12］在海人酸或荷包牡丹堿誘導的小鼠EP模型中發現，TLR4與HMGBl在海馬的神經細胞、星型膠質細胞、小膠質細胞均有表達。運用HMGBl或TLR4的拮抗劑，小鼠的癲癇點燃時間、發作次數及發作持續時間均有所下降。由此可見，EP的發作激活了TLR4炎癥反應信號通路，而這些通路的激活直接導致神經退行性病變，從而引起記憶功能損害。

雖然目前癲癇的發病病理機制尚未完全清楚，但近年眾多研究已表明，免疫炎癥反應與癲癇的發生發展有著密切的相關性。有研究表明，TLR4在腦中風的神經元死亡中起重要的作用，敲除TLR4后腦梗死的面積明顯減少，可以推斷TLR4在調控中樞炎癥介導的急性腦損傷中起重要作用，從而對學習記憶能力產生影響。本實驗結果顯示，隨著戊四唑造模時間延長以及丙泊酚的注射，各組癲癇大鼠的學習記憶能力呈明顯下降趨勢。我們通過TLR4在癲癇大鼠海馬內的表達情況可以觀察到丙泊酚以及聯合用藥組的TLR4的表達水平明顯增強，說明TLR4介導的中樞炎癥反應與學習記憶能力有一定相關性。

綜上所述，聯合應用苯巴比妥鈉、丙泊酚對認知和記憶有損害加深作用，對腦神經元有不可逆的損害。因此臨床上不建議丙泊酚作為靜脈麻醉藥應用于使用苯巴比妥鈉治療的癲癇患者。

Fig 4 Typical sw im－tacking path in probe trial in different groups

Fig 5 Expression of TLR4*P＜0.05 vs EP；＃P＜0.05 vs combination

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