烏司他丁對內毒素肺損傷大鼠的保護作用

林雪松,向軍,蔡亞娜,汪樂

(1.浙江省臺州市中心醫院燒傷科,臺州 318000;2.上海交通大學附屬瑞金醫院燒傷科,上海 200025)

烏司他丁對內毒素肺損傷大鼠的保護作用

林雪松1,向軍2,蔡亞娜1,汪樂1

(1.浙江省臺州市中心醫院燒傷科,臺州 318000;2.上海交通大學附屬瑞金醫院燒傷科,上海 200025)

目的 探討烏司他丁對急性內毒素性肺損傷保護作用的機制。方法取SD大鼠20只,大鼠腹腔注射脂多糖(LPS)5mg·kg-1·d-1,按隨機數字表法將大鼠分配進入烏司他丁組和對照組各10只。烏司他丁組靜脈給予烏司他丁50 kU·kg-1,對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液,觀察大鼠水通道蛋白-1(AQP-1),AQP-5的表達變化及肺泡壁厚度變化以及肺水腫的程度。結果對照組大鼠體內注射LPS后,AQP-1及AQP-5的表達持續性降低,烏司他丁組AQP-1及AQP-5降低不明顯;對照組肺組織濕/干質量比值明顯增高,烏司他丁組無明顯變化。對照組24,48,72 h的肺泡壁厚度(3.84±0.68),(6.32±1.08),(11.03±2.47)μm,烏司他丁組分別為(2.31±0.44),(3.76±0.82),(2.94±0.67)μm,無明顯變化。結論AQP-1及AQP-5通過調節細胞通透性而導致肺水腫,烏司他丁通過減緩上述過程從而減輕內毒素性肺損傷的程度。

烏司他丁;損傷,肺,急性;內毒素;水通道蛋白

機體嚴重創傷及感染后常伴有急性肺損傷,可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ARDS最初的病理生理變化是肺微血管內皮細胞損傷,引起微血管壁通透性增加,肺泡內及間質水腫、纖維素滲出,并損傷肺泡上皮,加重呼吸窘迫。因此,肺微血管通透性增加是急性肺損傷及ARDS等病變的一個關鍵因素。許多研究證實,通過抑制燒傷后炎癥反應,在一定程度上能改善燒傷后的臟器損傷。烏司他丁(ulinastatin)屬于蛋白酶抑制藥,有穩定溶酶體膜、抑制溶酶體酶釋放及進一步抑制過度炎癥反應的作用,廣泛應用于大面積燒傷及急性胰腺炎患者[1]。本實驗中,筆者一方面觀察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后肺組織炎癥因子及水通道蛋白(aquaporin,AQP)等功能蛋白的變化,另一方面應用烏司他丁觀察其對肺損傷的保護作用,從而初步探討烏司他丁對肺臟保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試藥及儀器 AQP-1及AQP-5單克隆抗體購于美國Abcam公司。配膠試劑:30%丙烯酰胺、1.5 mol·L-1Tris(pH8.8)、10%過硫酸銨(APS)、10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、雙蒸水等,電泳液:Tris 3.03 g,甘氨酸18.8 g,SDS 1 g,加純化水配制1 000 mL;轉膜液:Tris3.03 g,甘氨酸14.4 g,甲醇200 mL,加純化水配制1 000mL;封閉液:5%脫脂奶粉。主要儀器:多功能酶標儀、電泳設備、轉膜設備、濕盒、掃描設備等。LPS為大腸埃希菌脂多糖,上海慧穎生物科技有限公司,批號:20111105);烏司他丁(廣東天普生化醫藥股份有限公司,批號:031004141)。

1.2 實驗動物造模、分組 清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,體質量170～200 g,購于復旦大學動物實驗中心,生產許可證號:SCXK(滬)2009-0019,使用許可證號:SYXK(滬)2009-0082。予標準飼料,自由取水。按5 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射LPS。按隨機數字表法將大鼠分配進入烏司他丁組和對照組各10只。烏司他丁組靜脈給予烏司他丁50 kU·kg-1;對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。分別于注射LPS后0,24,48,72 h取材檢測。

1.3 肺組織標本收集 取血完畢后,沿胸骨旁夾斷肋骨,打開胸腔,暴露雙肺,自右側肺門游離右肺,速凍于液氮,保存于-80℃。

1.4 Western blot檢測肺組織AQP-1,AQP-5蛋白抽提肺組織總蛋白,測定肺組織總蛋白濃度,根據BCA蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit,PIERCE)流程說明書建立標準曲線,然后行SDS-PAGE電泳及蛋白質轉移,膜的封閉和抗體孵育,將膜置于反應液中室溫孵育5 min;去除過量的溶液,將膜夾在兩塑料薄膜之間,以X光膠片曝光,顯影圖片掃描并用Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。

1.5 肺組織切片染色及肺泡壁厚度測定 隨機選取每個組的每個時間點5張蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)切片,每張切片隨機選取視野2個,鏡下測量肺泡壁厚度,計算平均值。

1.6 肺組織濕/干質量比值 從各組大鼠左下肺切取肺組織200 mg,置于烘箱內80℃干烤24 h后,用托盤天平稱質量并計算肺組織濕/干質量(W/D)比值,以W/D比值表示肺組織含水量,比值越大說明肺水腫越明顯。

1.7 統計學方法 采用SPSS12.0版醫學統計軟件,變量以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,組內比較采用Dunnett's方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 烏司他丁對AQP-1,AQP-5的影響 注射LPS后AQP-1及AQP-5的表達持續性降低,而同時注射烏司他丁后,AQP-1及AQP-5降低不明顯。見圖1,2。

2.2 肺組織濕/干質量比值 注射LPS 48～72 h后,肺組織濕/干質量比值明顯增高,而烏司他丁組肺組織濕/干質量比值始終無明顯變化。見圖3。

2.3 肺泡壁厚度 注射LPS后,肺泡壁厚度明顯增大,而烏司他丁組肺泡壁厚度無明顯變化。見圖4,5。

A:對照組;B:烏司他丁組圖1 Western blot檢測AQP-1和AQP-5的表達A.Control group;B.Ulinastatin groupFig.1 Detection on exp ression of AQP-1 and AQP-5 by Western blotmethod

A.AQP-1;B.AQP-5;與對照組比較,*1P＜0.01;*2P＜0.05圖2 兩組不同時間AQP-1和AQP-5蛋白表達量A.AQP-1;B.AQP-5;Compared with the control group,*1P＜0.01;*2P＜0.05Fig.2 Expression of AQP-1 and AQP-5 between two groups in d ifferent time

3 討論

AQP對水的通透性具有高度選擇性,水分子可以通過水通道向高滲方向移動[2]。AQP-1在呼吸道及肺都有表達;AQP-5分布在Ⅰ型肺泡上皮細胞的頂膜上[1]。在肺泡上皮細胞的基底膜和側膜上以及呼吸道上皮細胞的頂膜上未發現AQP存在[3]。

與對照組比較,P＜0.01圖3 兩組不同時間肺組織濕/干質量比Compared with the control group,*1P＜0.01Fig.3 The wet/dry weight ratio of two groups at different time points

與對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01圖4 兩組不同時間肺泡壁厚度Compared with the control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01Fig.4 Thickness of alveolar walls of two groups at different time points

A、B、C為對照組24,48,72 h;D、E、F為烏司他丁組24,48,72 h圖5 兩組肺組織切片染色圖(HE,×400)A,B,Cwere control groups in 24,48,72 h,respectively;D,E,F were ulinastatin groups in 24,48,72 h,respectivelyFig.5 Lung histopathology of two groups of mice(HE,×400)

嚴重的大面積燒傷常伴有急性肺損傷,作為一種蛋白酶抑制藥,烏司他丁具有穩定溶酶體膜、抑制溶酶體酶釋放及進一步抑制過度炎癥反應的作用[1],廣泛應用于大面積燒傷患者。

肺組織濕/干質量比及肺泡壁厚度反映肺水腫的程度,經LPS刺激后,肺組織的水腫程度持續性加重,經烏司他丁干預后,肺組織濕/干質量比值及肺泡壁厚度變化不大,提示烏司他丁的重要的保護作用。

肺微血管內皮細胞通透性的增加導致肺水腫,內皮細胞通透性包括透細胞通透性及旁細胞通透性,內皮細胞膜表面有多種調節細胞通透性的蛋白,如AQP、caveolin及鈉通道,在本實驗中發現LPS可下調AQP-1及AQP-5,而烏司他丁干預后,AQP-1及AQP-5表達無明顯變化,同樣也提示烏司他丁對肺組織的重要的保護作用。在以往關于LPS或燒傷對肺組織AQP的影響的研究中發現,燒傷先引起肺組織AQP-1上調隨后下調表達,下調肺組織AQP-5的表達,其中關于AQP-1的研究與本實驗結果并不一致。筆者推測LPS刺激或燒傷后AQP-1的上調表達可能發生在較短時間內,即發生在LPS刺激早期,是對LPS刺激的急性反應,或者說是對LPS刺激后機體產生的代償性保護作用。而在LPS持續的不間斷的刺激下,機體產生對LPS的不同程度的耐受,這種保護性代償反應隨之消失,使AQP-1表達下調,肺組織微血管內皮細胞和肺泡上皮細胞水鈉轉運失調,肺水腫逐漸加重。

[1] ZHANG Y W,BI L T,HOU SP,et al.Reduced lung water transport rate associated with downregulation of aquaporin-1 and aquaporin-5 in aged mice[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(7):734-738.

[2] ECHEVARRIA M,MUNOZ-CABELLO A M,SANCHEZSILVA R,et al.Development of cytosolic hypoxia and hypoxiainducible factor stabilization are facilitated by aquaporin-1 expression[J].J Biol Chem,2007,282(41):30207-30215.

[3] GAO C,HUAN J,LIW,et al.Protective effects of ulinastatin on pancreatic and renal damage in rats following early scald injury[J].Burns,2009,35(4):547-552.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.006

Protective Effect of Ulinastatin on LPS-induced Lung Injury

LIN Xue-song,XIANG Jun,CAI Ya-na,WANG Le
(1.Department of Burn,Taizhou Central Hospital, Taizhou 318000,China;2.Department of Burn&Plastic Surgery,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200025,China)

ObjectiveTo investigate the protection mechanism of ulinastatin on bacterial endotoxin-induced acute lung injury.MethodsAcute lung injury was induced by Escherichia colilipo-polysaccharide(LPS)5 mg·kg-1·d-1,intratracheally. Twenty SD ratswere randomly divided into controlgroup(n=10)and ulinastatin group(n=10).Ulinastatid group received ulinastatin 50 kU·kg-1,the control groups received the same amount of 0.9%sodium chloride solution.Then the expression changes of rat AQP-1 and AQP-5,alveolar wall thickness change and the degree of pulmonary edema were detected.ResultsAfter the injection of LPS into the rat,the expression of AQP-1 and AQP-5 in control group were continuously decreased,but those in ulinastatin group decreased were not obvious.The lung wet/dry weight ratio in the control group increased significantly,the not obvious changes in the ulinastain group.The thickness of the alveolar in 24,48,72 h of the control group were(3.84±0.68),(6.32±1.08),(11.03±2.47)μm, respectively,and those in the ulinastian groupswere(2.31±0.44),(3.76±0.82),(2.94±0.67)μm,respectively.ConclusionThe AQP-1 and AQP-5 induced the occurrence of pulmonary edema by changing the cell permeability.Ulinastatin can slow down the process so as to reduce the degree of endotoxin-induced lung injury.

Ulinastatin;Injury,lung,acute;Endotoxin;Aquaporin

R965

A

1004-0781(2014)06-0718-04

2013-10-15

2014-01-20

林雪松(1970-),男,浙江臺州人,副主任醫師,學士,從事燒傷外科臨床工作。電話:(0)15257699000,E-mail:linxuesg@163.com。

向軍(1968-),男,上海人,副主任醫師,碩士,從事燒傷科工作。電話:(0)13801789791,E-mail:13801789791@163.com。