吡非尼酮對大鼠肝細胞色素P450酶活性的影響

吳際,陳匯,吳健鴻,周順長,曾繁典

(1.武漢科技大學城市學院,武漢 430083;2.華中科技大學同濟醫學院藥理教研室,武漢 430030;3.武漢藥品醫療器械檢驗所,武漢 430075;4.華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心,武漢 430030)

吡非尼酮對大鼠肝細胞色素P450酶活性的影響

吳際1,陳匯2,吳健鴻3,周順長4,曾繁典2

(1.武漢科技大學城市學院,武漢 430083;2.華中科技大學同濟醫學院藥理教研室,武漢 430030;3.武漢藥品醫療器械檢驗所,武漢 430075;4.華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心,武漢 430030)

目的 闡明吡非尼酮(PF)對大鼠肝臟細胞色素P450總酶及其同工酶的影響。方法采用差示分光光度法測定大鼠肝微粒體總酶、二甲基亞硝胺N-脫甲基酶(NDMA)、紅霉素N-脫甲基酶(ERD)的活性。SD大鼠56只,隨機分為溶酶對照組、肝藥酶誘導劑組、肝藥酶抑制劑組,乙醇誘導組、吡非尼酮低劑量組、中劑量組和高劑量組。溶酶對照組給予1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),誘導劑組0.5%地塞米松100 mg·kg-1,肝藥酶抑制劑組1%酮康唑40 mg·kg-1,吡非尼酮低、中、高劑量組為PF25,50,100mg·kg-1灌胃給藥,1日1次,連續6和12 d。取大鼠肝臟制備肝微粒體,測定肝微粒體中蛋白濃度,用分光光度計對樣品進行比色。結果灌胃給藥6 d后,吡非尼酮中、高劑量組(50,100 mg·kg-1)對P450總酶有明顯的誘導作用,與溶媒對照組(1%CMC-Na)比較差異有統計學意義(P＜0.01);在給藥6和12 d后,吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶的活性影響不顯著(P＞0.05),而對大鼠肝微粒體ERD酶具有顯著的誘導作用(P＜0.01)。結論吡非尼酮中、高劑量組對大鼠肝藥酶總酶及ERD酶具有誘導作用,且隨著劑量和時間的增加,誘導作用增加。

吡非尼酮;細胞色素P450酶;酶活性

吡非尼酮(pirfenidone)是一種新型的廣譜抗肺纖維化藥物,其結構是5-甲基1苯基2(1氫)吡啶酮(5-methyl-1-phenyl-2(1H)-pyridone),能夠防止甚至逆轉纖維化發生和瘢痕形成,能抑制膠原的合成,減少多種細胞因子的產生,抑制成纖維細胞的增殖及其相應細胞因子的作用。本品系首個批準用于治療特發性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的藥物,我國已作為一類新藥批準生產。筆者擬對吡非尼酮進行臨床前藥動學研究及對肝細胞色素P450酶(CYP)的影響,對該藥臨床應用的可行性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠,體質量200～240 g,雌雄兼有,購自武漢大學實驗動物中心,許可證號:SCXK (鄂)2004-0004。

1.2 試藥 吡非尼酮為上海睿星基因技術有限公司提供,含量＞99%,酮康唑(西安楊森制藥有限公司,批號:010803649);醋酸地塞米松注射液(湖北天藥藥業股份有限公司,批號:030308),紅霉素、二甲基亞硝胺、6-磷酸葡萄糖二鈉、6磷酸葡萄糖脫氫酶、氧化型輔酶Ⅱ(NADP)均為Sigma公司產品,甲醛、乙酰丙酮、連二亞硫酸鈉等為國產分析純試劑,BCA試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司生產。

1.3 儀器 低溫高速離心機(3-18K,Sigma公司);酶標儀(Elx 800);超低溫冰箱(-86℃)(NCLAIR);721紫外-可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.4 分組與給藥 SD大鼠共56只,分為7組,每組大鼠8只,雌雄各半。溶媒對照組[給予1%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na) 10 mL·kg-1];地塞米松藥酶誘導組(給予0.5%地塞米松100 mg·kg-1);酮康唑藥酶抑制組(給予1%酮康唑40 mg·kg-1);乙醇誘導組(給予50%乙醇5 mL·kg-1);吡非尼酮低、中、高劑量組(給予吡非尼酮25,50,100 mg·kg-1)。分別灌胃給藥6,12 d后處死動物,取肝臟制備微粒體。

1.5 微粒體制備 采用鈣沉淀法制備肝臟微粒體。肝臟組織勻漿后于2℃,10 000×g離心15 min,再取上清液與88 mmol·L-1氯化鈣溶液混勻,冰浴5 min。2℃,27 000×g離心15 min,棄上清液,微粒體沉淀以0.25 mol·L-1蔗糖溶液重懸,-70℃保存備用[1]。

1.6 藥物代謝酶測定 CYP含量的測定采用差示分光光度法。二甲基亞硝胺N-脫甲基酶(dimethyl nitrosamineN-demethylase,NDMA)活性和紅霉素N-脫甲基酶(erythromycinN-demethylase,ERD)活性測定用分光光度法,二甲基亞硝胺和紅霉素的終濃度分別為10 mmol·L-1和0.4 mmol·L-1。蛋白含量測定采用BCA試劑法[2]。

1.7 統計學方法 數據結果以均數±標準差(±s)表示,采用DAS ver1.0統計軟件進行正態性檢驗、方差分析和Q值檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠CYP活性 結果見表1。CYP總酶方差分析見表2。組間兩兩比較見表3。從表1可見,給藥6 d時,與溶媒對照組比較,地塞米松藥酶誘導組可使大鼠CYP含量增加(P＜0.01),酮康唑藥酶抑制組可CYP含量減少(P＜0.01)。吡非尼酮低劑量組CYP含量雖有增加,但差異無統計學意義(P＞0.05),當吡非尼酮劑量增加至50 mg·kg-1時則可明顯增加CYP含量,表現為劑量依賴性。

2.2 大鼠肝微粒體NDMA酶活性 結果見表4。從表2可見,給藥6 d時,中和高劑量吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶活性無影響(P＞0.05),乙醇誘導組NDMA酶活性有誘導作用(P＜0.01)。給藥12 d時,中和高劑量吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶活性仍無影響。

2.3 大鼠肝微粒體ERD酶活性 結果見表5。從表3可見,給藥6 d時,地塞米松誘導組可使大鼠肝微粒體ERD酶活性增加(P＜0.01),吡非尼酮中和高劑量組對大鼠肝微粒體ERD酶活性均有誘導作用(P＜0.01),同時吡非尼酮高劑量組誘導作用高于吡非尼酮中劑量組。給藥12 d時,各用藥組肝微粒體ERD酶活性進一步增加,吡非尼酮高劑量組誘導作用仍高于吡非尼酮中劑量組,表現出明顯的劑量和時間依賴性。

表1 6組大鼠肝微粒體中CYP活性的測定值Tab.1 Determ ination results of CYP activity in liver microsome of six groups of the rats±s

表1 6組大鼠肝微粒體中CYP活性的測定值Tab.1 Determ ination results of CYP activity in liver microsome of six groups of the rats±s

與溶媒對照組比較,*1P＜0.01Compared with solvent control group,*1P＜0.01

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表2 方差分析表Tab.2 Analysis of variance

3 討論

肝微粒體CYP的含量測定一般采用經連二亞硫酸鈉還原的肝微粒體懸浮液的一氧化碳(CO)差光譜計算。但是由于在標本收集時,很難用門靜脈灌洗,所以在制備微粒體時混有較多的血紅蛋白,在測定CYP的濃度時血紅蛋白-CO復合物可干擾還原型P450-CO復合物的吸收光譜。為此,本實驗用通CO微粒體懸浮液的連二亞硫酸鈉差光譜計算,可消除血紅蛋白對測定的干擾。

CYP是藥物代謝酶系統中重要組成部分,參與藥物或毒物的代謝,有200多種化合物可誘導CYP的產生,在肝微粒體中使CYP含量增加,另一些藥物可抑制其活力,使肝微粒體中CYP產生減少[3]。本實驗采用典型的CYP誘導劑地塞米松及抑制劑酮康唑進行實驗,分別出現明顯的CYP增加及減少效應,說明本實驗的方法是可行的,其結果有可比性。

表3 肝微粒體中CYP含量測定組間統計分析(Q值)Tab.3 Intergroup statistical analysis on CYP content in liver microsomes

表4 吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶活性影響的統計分析Tab.4 Statistical analysis on the effect of pirfenidone on NDM A activity of rat liver microsom es n=4,±s

表4 吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶活性影響的統計分析Tab.4 Statistical analysis on the effect of pirfenidone on NDM A activity of rat liver microsom es n=4,±s

與溶媒對照組比較,*1P＜0.01;與乙醇誘導組比較,*2P＜0.01Compared with solvent control group,*1P＜0.01;Compared with alcohol-induced group,*2P＜0.01

組別劑量/ (mg·kg-1) 6 d活性/ (nmol·min-1·mg-1)誘導率/誘導率/ % 12 d活性/ (nmol·min-1·mg-1) %溶媒對照組…0.844±0.041…0.866±0.058…乙醇誘導組5mL·kg-12.245±0.056*161.5 3.676±0.100*175.5吡非尼酮中劑量組50 0.931±0.066*211.2 0.954±0.06*28.9高劑量組100 0.938±0.086*213.6 1.044±0.135*221.6

表5 吡非尼酮對大鼠肝微粒體ERD酶活性影響的統計分析Tab.5 Statistical analysis on the effects of pirfenidone on ERD activity of rat liver microsom es n=4,±s

表5 吡非尼酮對大鼠肝微粒體ERD酶活性影響的統計分析Tab.5 Statistical analysis on the effects of pirfenidone on ERD activity of rat liver microsom es n=4,±s

與溶媒對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05;與地塞米松藥酶誘導組比較,*3P＜0.01Compared with solvent control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05;Compared with dexamethasone group,*3P＜0.01

組別劑量/ (mg·kg-1) 6 d活性/ (nmol·min-1·mg-1)誘導率/誘導率/ % 12 d活性/ (nmol·min-1·mg-1)%溶媒對照組…0.790±0.125…0.866±0.058…地塞米松藥酶誘導組100 1.575±0.148*146.9 3.676±0.100*175.5吡非尼酮中劑量組50 1.128±0.119*2*326.6 0.954±0.06*38.9高劑量組100 1.261±0.060*2*313.6 1.044±0.135*2*321.6

CYP3型酶與體內一些內源性和外源性化合物的代謝有關,并可被類固醇、大環內酯類抗生素、抗真菌藥物及苯巴比妥誘導。此亞型酶在體內占CYP總量70%,占肝內CYP 30%。在人體內,目前已發現4種CYP3A基因,即CYP3A3,CYP3A4,CYP3A5和CYP3A7,其中CYP3A4是在肝內含量較高,是人體內鎮痛藥芬太尼氧化代謝的主要酶[4]。紅霉素N-脫甲基酶是一種CYP同工酶,測定此酶主要反映CYP3A的活性。

CYP2E1最早在兔肝微粒體中分離純化出來,其特征為能被乙醇誘導,并被命名為P450LM3a,迄今發現所有CYP2E1的底物在人和動物中都是相同的,因此研究動物的CYP2E1對人具有重要參考意義。本實驗通過測定NDMA酶活性來反映CYP2E1的活性。值得一提的是,大量的研究已證明,乙醇是一種典型的CYP2E1誘導劑。許多易揮發性麻醉劑的體內代謝都與CYP2E1有關(如氟甲氧氟烷、異丙氧氟烷、甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、三氧甲烷等);芳香族類化合物(如苯、對乙酰氨基酚、二甲基亞硝胺)的代謝也與CYP2E1有關[5]。KHARASCH等[6]研究發現此酶可被異煙肼等誘導。慢性乙醇中毒者可增強體內苯巴比妥、利福平等的代謝率,加快這些藥物的排泄速度,認為此作用可能與CYP2E1被誘導有關;相反,急性乙醇中毒者又可能因乙醇競爭與CYP2E1結合,從而減慢上述同類藥物的代謝速度。由于CYP2E1的活性存在個體和種族的差異,其底物主要是人們經常接觸的前致癌物和前毒物,因此鑒定更多由CYP2E1催化代謝的藥物和化學物質對于指導臨床合理用藥是必不可少的。

從統計分析結果可以看出,吡非尼酮中劑量組、高劑量組和溶媒對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01),并且隨著劑量的增加,CYP的含量也在增加;地塞米松和乙醇分別使藥酶的活性大大增強(P＜0.01),吡非尼酮中、高劑量對CYP3A有顯著的誘導性(P＜0.05),隨著時間的增加誘導作用也會增強,而對CYP2E1則無影響(P＞0.05)。

[1] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].2版.北京:人民衛生出版社,2002:489.

[2] 張均田.現代藥理實驗方法(下冊)[M].北京:北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社,1998:1651-1652.

[3] JOHANNESEN K A,DEPIERRE JW.Measurement of cytochrome P450in the presence of large amounts of contam inating hemoglobin and methemoglobin[J].Anal Biochem,1978,86 (2):725-732.

[4] KHARASCH E D,THUMMEL K E.Human alfentanilmetabolism by cytochrome P4503A3/4.an explanation for the interindividual veaiebility in alfentanil clearance?[J]. Anesth Analg,1993,76(5):1033-1039.

[5] LIEBER C S.Cytochrome P4502E1:its physiological and pathological role[J].Physiol Rev,1997,77(2):517-544.

[6] KHARASCH E D,KARO M D,LANNI C,et al.Clinical sev of lurane metabolism and dispositionⅡ.The role of cytochrome P4502E1 in fluoride and hexafluoroisopropaol formation[J].Anesthesiology,1995,82(6):1379-1388.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.008

Effect of Pirfenidone on Activity of Hepatic Cytochrome P450in Rats

WU Ji1,CHEN Hui2,WU Jian-hong3,ZHOU Shun-chang4,ZENG Fan-dian2
(1.City College,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430083,China;2.Department of Pharmacology,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;3.Wuhan Institute for Drug and Medical Derice Control,Wuhan 430075,China;4.Animal Eχperimental Center,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

ObjectiveTo study the effects of pirfenidone on total enzyme and isoenzyme of liver microsomal cytochrome P450in rats.MethodsThe activites of liver microsomal dimethyl nitrosam ine N-demethylase(NDMA)and erythromycin demethylase(ERD)were determined.Fifty-six SD rats were random ly divided into six groups,in which they received CMC,dexamethasone 100 mg·kg-1,ketoconazole 40 mg·kg-1,pirfenidone 25,50,100 mg·kg-1,respectively.After administration for 6 and 12 days,liverswere prepared livermicrosome,the concentration of proteinum inmicrosome and shade selection to plasma samples were determined by spectrophotometer.ResultsAfter administration of pirfenidone for 6 days, cytochrome P450was significantly increased in 50 and 100 mg·kg-1pirfenidone groups,as compared with solvent control group (1%sodium carboxymethylcellulose)(P＜0.01).After administration of pirfenidone for6 and 12 days,NDMA of livermicrosome was not changed significantly(P＞0.05).ERD of livermicrosome was significantly increased in 100mg·kg-1pirfenidone group after administration for 12 days(P＜0.01).ConclusionPirfenidone can induce P450and ERD activities in a dose-and timedependentmanner.

Pirfenidone;Cytochrome P450;Enzyme activity

R965

A

1004-0781(2014)06-0723-04

2013-07-19

2013-12-21

吳際(1978-),男,湖北武漢人,講師,碩士,從事臨床藥理研究。電話:(0)13871593295,E-mail:wuji003@outlook.com。

曾繁典(1939-),男,湖北京山人,教授,博士生導師,從事臨床藥理研究。電話:027-83693628,E-mail:fdzeng@163.com。