丹參膠囊質量標準研究*

程月發,藍建芳,任新平,張珺,謝躍生

(1.河北聯合大學冀唐學院,唐山 063300;2.海南賽立克藥業有限公司,?？?571124)

丹參膠囊質量標準研究*

程月發1,藍建芳2,任新平2,張珺1,謝躍生1

(1.河北聯合大學冀唐學院,唐山 063300;2.海南賽立克藥業有限公司,?？?571124)

目的 建立丹參膠囊的質量標準。方法參照《中華人民共和國藥典》丹參藥材的質量標準,分別采用熒光反應、薄層色譜(TLC)鑒別法對丹參膠囊內容物進行丹參酮ⅡA定性鑒別;采用高效液相色譜(HPLC)法進行丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛5種主要成分的含量測定。結果丹參酮ⅡA的TLC鑒別分離度好,專屬性強。HPLC檢測的濃度范圍:丹參酮ⅡA在2.046～40.92μg·mL-1、隱丹參酮在1.482 25～59.29μg·mL-1、丹酚酸B在1.502 55～60.102μg·mL-1、丹參素在11.49～459.582μg·mL-1、原兒茶醛在0.617 4～24.696μg·mL-1分別具有良好的線性關系,相關系數r均為0.999 9,平均加樣回收率分別為99.66%(RSD=0.91%),99.26%(RSD=0.88%), 99.09%(RSD=0.76%),100.51%(RSD=0.62%)和100.62%(RSD=0.82%)。3批號丹參膠囊中,除原兒茶醛檢出量較低外,其余4種成分均有一定的含量。結論建立的鑒別、檢查與含量測定方法,簡便、準確,重復性好,可用于丹參膠囊的質量控制。

丹參膠囊;質量標準;活性成分;色譜法,高效液相;色譜法,薄層

丹參膠囊是單味丹參藥材通過醇提和水提工藝制得的膠囊制劑,功能為活血化瘀,主要用于治療冠心病、心絞痛等疾病。經醇提的成分主要為丹參酮ⅡA和隱丹參酮等二萜醌類化合物,經水提的成分主要為丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛等酚酸類化合物。為保證丹參膠囊產品有效成分的穩定性和可靠性,建立簡便易行的鑒別、測定方法和控制標準,筆者對丹參膠囊進行了質量標準的規范研究,現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀、可變波長掃描紫外檢測器和Agilent Chemstation色譜工作站(均為美國Agilent公司);BP211D型電子天平(德國Sartorius);SK5200H超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司,頻率53 kHz,功率200 W)。

1.2 藥品與試藥 丹參膠囊(批號:110401,110701, 110901,供鑒別及檢查實驗,120901,120902,120903,供含量測定實驗,規格:每粒0.28 g)由海南賽立克藥業有限公司提供,空白對照膠囊制備除丹參提取物外,按處方量稱取輔料,混勻即得。甲醇、乙腈為色譜純;重蒸水(自制);其他試劑均為國產分析純。

1.3 對照品 丹參對照藥材(批號:120923-200509)、丹參酮ⅡA對照品(批號:110766-200619)、丹酚酸B對照品(批號:111562-201212),均購于中國食品藥品檢定研究院;隱丹參酮(批號:GZDD-0096-201112)、丹參素鈉對照品(批號:0071-201102)、原兒茶醛對照品(批號:GZDD-0806-201201)均購自貴州迪大生物有限公司,純度≥98%(實驗中計算按純度98%執行)。

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 熒光反應 取本品1粒的內容物,研細,加乙醇5 m L,充分攪拌,濾過,取濾液數滴,滴在濾紙上,干燥后,置紫外光燈(365 nm)下觀察,顯藍色熒光;將濾紙條置氨蒸氣中熏20 min,取出,置紫外光燈(365 nm)下觀察,顯淡亮藍綠色熒光。另取空白膠囊內容物,按供試品的熒光鑒別實驗進行陰性對照實驗。對3批次的供試品進行檢查,3批供試品均呈現相應的熒光反應;空白膠囊均未呈現熒光反應。

2.1.2 薄層色譜 取3批膠囊各10粒的內容物,研細,混勻,加乙醚20 mL,置具塞試管中,放置1 h,濾過,濾液揮干,殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解,作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。取丹參酮ⅡA對照品,加乙酸乙酯制成濃度2 mg·mL-1,作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環己烷-乙酸乙酯(6∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點;在與對照品色譜相應的位置上,顯相同的暗紅色斑點。

2.2 檢查

2.2.1 一般項目 膠囊劑的水分、裝量差異、崩解時限、重金屬、微生物限度檢查按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄[1]進行,均符合標準。

2.2.2 砷鹽 取3批樣品,按《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)附錄ⅦJ第一法進行測定。結果表明,砷在樣品中含量均＜1 ppm。

2.3 含量測定 丹參酮ⅡA、丹酚酸B遵照《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)中規定的方法[1];丹參素按照《中華人民共和國藥典》2005年版一部中規定的方法[2];原兒茶醛按照國家藥品標準《WS-10149 (ZD-0149)-2002丹參顆?！分幸幎ǖ姆椒?隱丹參酮參照有關文獻辦法,分別進行含量測定[3]。

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對照品溶液的制備 分別按照文獻辦法制備丹參酮ⅡA含量為16μg·mL-1、隱丹參酮和丹酚酸B含量各為10μg·mL-1、丹參素鈉含量為100μg·mL-1(相當于丹參素90μg·mL-1)和原兒茶醛含量為5μg·mL-1的對照品溶液。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 取10粒丹參膠囊內容物,精密稱定、研細、混勻,取約0.3 g,精密稱定,置磨口錐形瓶中,精密加入甲醇50 mL,塞緊,稱定質量,加熱回流1 h,放冷后,密塞,稱定質量,用甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,即得丹參酮ⅡA供試品溶液提取液。取本品內容物約0.35 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加入流動相約35 mL,超聲處理15 min,放冷,再用流動相稀釋至刻度,搖勻,過濾,取續濾液,即得隱丹參酮供試品溶液。取本品內容物約0.2 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,加水適量,超聲處理20 min,放冷,加水至刻度,搖勻,濾過,精密量取續濾液1 m L,置25 mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得丹酚酸B供試品溶液。取本品內容物約0.45 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,加流動相約15 mL,超聲處理15 min,放冷,加流動相至刻度,搖勻,2 000 r·min-1離心5 min,取上清液,即得丹參素供試品溶液。取本品內容物約1.3 g,精密稱定,置50 m L量瓶中,加入流動相約35 mL,超聲處理15 min,放冷,加流動相稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得原兒茶醛供試品溶液。

2.3.1.3 陰性對照品溶液制備 如上法分別取空白膠囊內容物約0.5 g,分別精密稱定,按法分別制備5種待測成分的陰性對照品溶液。

2.3.2 色譜條件與系統適用性實驗

2.3.2.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18stableBond Analytical(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫: 35℃。丹參酮ⅡA測定以甲醇-水(75∶25)為流動相;檢測波長:270 nm,理論板數按丹參酮ⅡA峰計算應不低于2 000。隱丹參酮測定以乙腈-水(80∶20)為流動相;檢測波長:263 nm,理論板數按隱丹參酮峰計算應不低于2 000。丹酚酸B測定以甲醇-乙腈-冰醋酸-水(30∶10∶1∶59)為流動相;檢測波長:286 nm,理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于4 000。丹參素測定以0.5%冰醋酸-甲醇(88∶12)為流動相,檢測波長:280 nm;理論板數按丹參素峰計算應不低于2 000。原兒茶醛測定以0.5%冰醋酸-甲醇(88∶12)為流動相,檢測波長:280 nm;理論板數按原兒茶醛峰計算應不低于6 000。以上進樣量均為20μL,流速均為1 mL·min-1。

2.3.2.2 系統適用性實驗 在上述各自色譜條件下,分別精密吸取5種成分的對照品、供試品和陰性對照品溶液各20μL注入液相色譜儀,記錄圖譜。實驗結果表明供試品的色譜圖中,分別有一個色譜峰與對照品色譜峰的相對保留時間一致,陰性對照品在與對照品相同保留時間位置上,色譜圖中沒有出現丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的吸收峰。結果理論板數、分離度和拖尾因子均符合要求,在各自色譜條件下,樣品得到良好分離。

2.3.3 線性關系考察 分別配制質量濃度丹參酮ⅡA為204.6μg·mL-1、隱丹參酮為59.29μg·mL-1L、丹酚酸B為60.102μg·mL-1、丹參素為459.582 3μg·mL-1和原爾茶醛為123.48μg·mL-1的對照品貯備液,然后再用各自溶劑稀釋成不同質量濃度的的測試液,進樣測定,記錄色譜峰面積。分別以峰面積(Y)對照品質量濃度(X,μg·mL-1)繪制標準曲線,進行線性回歸,得回歸方程。結果見表1。

表1 5種成分線性關系實驗結果Tab.1 Experimental result of linear relation of five kinds of constituents

2.3.4 精密度實驗 取丹參酮ⅡA對照品10.23 mg,置50 mL量瓶中,甲醇超聲溶解稀釋至刻度。搖勻,精密吸取2 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。取隱丹參酮對照品10.89 mg,流動相稀釋1 000倍。取丹酚酸B對照品12.60 mg,流動相稀釋1000倍。取丹參素鈉對照品10.42 mg,流動相稀釋100倍。取原爾茶醛對照品12.60 mg,置25 mL量瓶中,加流動相超聲溶解并稀釋至刻度。搖勻,精密吸取1 mL,置100 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。分別吸取上述對照品溶液各20μL,連續進樣6次,分別測定峰面積,計算RSD。結果丹參酮ⅡA對照品峰面積平均值為2 041.94,RSD為0.25%;隱丹參酮對照品峰面積平均值為1 223.27,RSD為0.04%;丹酚酸B對照品峰面積平均值為299.75,RSD為0.24%;丹參素對照品峰面積平均值為1459.90,RSD為0.21%。原爾茶醛對照品峰面積平均值為448.67,RSD為0.07%。

2.3.5 重復性實驗 取批號120901丹參膠囊,平行取樣品各6份,精密稱定,依法分別配制成丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛供試品溶液,連續進樣測定,計算含量。結果丹參酮ⅡA的RSD為0.85%、隱丹參酮的RSD為0.88%、丹酚酸B的RSD為0.89%、丹參素的RSD為0.82%、原爾茶醛的RSD為0.92%。

2.3.6 穩定性實驗 取批號120903供試品適量,分別配制5種成分的供試品溶液,置棕色量瓶中密閉保存,常溫下分別于0,2,4,6,8 h,按各自色譜條件進行測定,計算峰面積和RSD。結果丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的峰面積RSD分別為0.82%,0.54%,1.46%,0.39%和0.84%。說明5種成分的溶液在避光密閉容器中保存,含量變化不大,比較穩定。

2.3.7 加樣回收率實驗 取丹參膠囊供試品(已知丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的質量分數分別為0.24%,0.15%,5.08%,0.53%, 0.02%)各9份,平均分成3組。分別精密添加不同質量濃度的對照品儲備液,每個梯度平行3份;然后按“2.3.1.2”項方法制備樣品溶液,按法處理并測定含量,計算回收率。結果見表2。

2.3.8 樣品含量測定 取3批丹參膠囊,分別按“2.3.1.2”項下方法制備供試品溶液,按相應的色譜條件對供試品進行丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的含量測定(每批3次),用外標法計算,取均值。結果見表3。

3 討論

3.1 丹參膠囊的質量標準制定依據 丹參含有以丹參酮為主的脂溶性成分和以酚酸為主的水溶性成分,其中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量較高,分別為藥材的0.1%～0.9%和2%～8%,成為丹參藥材質量評價的主要指標[4-5]。《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)規定丹參藥材用高效液相色譜法測定,含丹參酮ⅡA(C19H25O3)應不得少于0.20%,丹酚酸B(C36H30O16)不得少于3.0%[1]。以丹參單味藥材和以丹參為主藥開發的復方制劑劑型多達十余種,該類制劑廣泛應用于心、腦血管疾病的臨床治療。但丹參制劑的質量標準一直存在某些爭議[6],一般是針對不同提取方法、生產工藝和劑型的產品,圍繞著水溶性酚酸類和脂溶性菲醌類兩大類型活性成分開展質量控制。例如丹參片規定測定丹酚酸B的含量(每片折合質量分數相當于3.67%);復方丹參片和復方丹參顆粒都以丹參酮ⅡA和丹酚酸B作為含量測定指標[1];而丹參顆粒、丹參合劑、丹參口服液、丹參注射液等則以原兒茶醛為質量控制成分[7],丹參滴丸則以丹參素為控制對象。丹參膠囊則除了采用薄層色譜法定性丹參酮ⅡA外,還同時采用高效液相色譜法測定丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的含量,質量控制兼顧丹參膠囊的水溶性和脂溶性兩大類主要活性成分。測定結果表明,除原兒茶醛含量較低之外,其他4種活性成分含量均相對較高,且與丹參原料藥的成分含量分布比較一致,較單純選擇丹參酮ⅡA和丹酚酸B控制制劑質量更客觀,更實用。關于限量標準,仍然建議以《中華人民共和國藥典》標準中相同或者相似劑型的質量分數作為參考來制定。為更好地進行質量控制,筆者下一步擬對該品種的指紋圖譜標準進行深入研究。

表2 5種成分加樣回收實驗結果Tab.2 Results of recovery tests on five kinds of constituents

續表2 5種成分加樣回收實驗結果Tab.2 Results of recovery tests on five kinds of constituents

表3 丹參膠囊樣品含量測定結果Tab.3 Results of conten t determ ination on sam p les of Danshen capsules %,±s

表3 丹參膠囊樣品含量測定結果Tab.3 Results of conten t determ ination on sam p les of Danshen capsules %,±s

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3.2 丹參膠囊與丹參舒心膠囊質量標準的比較 丹參舒心膠囊也是單味丹參藥材提取物制得的膠囊劑,原為衛生部藥品標準中藥成方制劑第7冊所收載,其主要是提取脂溶性部位入藥,標準內容簡單,關鍵項目為丹參酮ⅡA薄層層析鑒別,沒有含量測定[8]。由于該產品開發較早,丹參提取物的工藝過于簡單,設計上也存在一些缺陷,因而導致產品質量參差不齊,含量差異懸殊[9]。因為缺乏定量標準,導致國內對該產品的質量標準研究方法多種多樣,存在定量指標難以統一的問題[10-15]。而丹參膠囊是研究者根據[Z]GPH3-1《中藥、天然藥物制劑研究技術指導原則》(第二稿)的相關規定,在參閱相關標準和文獻的基礎上,采用丹參藥材脂溶性和水溶性有效部位均入藥的思路研制而成,較好地提升了制劑的質量。因此,筆者認為,在理想狀態下,既然現有的技術工藝已經完全能夠滿足同時提取丹參的兩大類有效成分,丹參藥材作為單一入藥的原料,其制劑應該盡量參照《中華人民共和國藥典》中該藥材的質量標準來制定,以確保臨床療效。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.027

Study on Quality Standard of Danshen Capsules

CHENG Yue-fa1,LAN Jian-fang2,REN Xin-ping2,ZHANG Jun1,XIE Yue-sheng1
(1.Jitang College of Hebei United University,Tangshan 063300,China;2.Hainan Selection Pharmaceutical Co.,Ltd,Haikou 571124, China)

ObjectiveTo establish a new quality control standard fordanshencapsules.MethodsThe qualitative identification ofdanshencapsules was characterized by ultraviolet fluorescence and thin-layer chromatography(TLC).The contents of tanshinoneⅡA,cryptotanshinone,salvianolic acid B,danshensuand protocatechuic aldehyde indanshencapsuleswere determined by high performance liquid chromatography(HPLC)on a C18column.The flow rate was 1 mL·min-1,and the column temperature was 35℃.ResultsThe HPLC linear ranges of tanshinoneⅡA,cryptotanshinone,salvianolic acid B,danshensuand protocatechuic aldehyde were 2.046-40.92μg·mL-1,1.482 25-59.29μg·mL-1,1.502 55-60.102μg·mL-1,11.49-459.582μg·mL-1,and 0.617 4-24.696μg·mL-1,respectively,andrvalueswere 0.999 9.The average recoverieswere99.66%(RSD of 0.91%)for tanshinoneⅡA,99.26%(RSD of 0.88%)for cryptotanshinone,99.09% (RSD of 0.76%)for salvianolic acid B,100.51%(RSD of 0.62%)fordanshensu,and 100.62%(RSD of 0.82%)for protocatechuic aldehyde,respectively.The contents of the tanshinoneⅡA,cryptotanshinone,salvianolic acid B,danshensushowed a certain high level in the 3 batches ofdanshencapsule samples,but protocatechuic aldehyde was low by comparison.ConclusionThe HPL Cmethod is proven to be sensitive,accurate,repeatable,and can be used for quality control of thedanshencapsules.

Danshencapsules;Quality standard;Active component;Chromatography,high performance liquid; Chromatography,thin-layer

R286;R927.11

A

1004-0781(2014)06-0785-05

2013-08-06

2013-11-20

*唐山市2013年科學技術研究與發展基金項目(13130298z)

程月發(1967-),男,安徽桐城人,博士,主要研究方向:天然產物藥理學。電話:0315-8114108,E-mail:arthurcyf@163.com。