高效液相色譜法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)

曹振民,王超眾,劉磊,賈首時(shí),王萌萌

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科,齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,齊齊哈爾 161006;3.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院藥劑科,齊齊哈爾 161005;4.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,齊齊哈爾 161005)

高效液相色譜法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)

曹振民1,王超眾2,劉磊3,賈首時(shí)2,王萌萌4

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥劑科,齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省齊齊哈爾市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,齊齊哈爾 161006;3.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院藥劑科,齊齊哈爾 161005;4.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,齊齊哈爾 161005)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)。方法采用ZORBAX Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6mm×150 mm,5μm),以0.1%庚烷磺酸鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相,流速為1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果氫溴酸山莨菪堿在5～200μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程:A=31.59C+5.930,r=0.999 8(n=6),平均回收率為100.16%(RSD=1.08%)。供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好(RSD=0.6%),定量限為50 ng。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,適用于氫溴酸山莨菪堿注射液的質(zhì)量控制。

山莨菪堿注射液,氫溴酸;色譜法,高效液相;含量測(cè)定;有關(guān)物質(zhì);質(zhì)量控制

氫溴酸山莨菪堿為莨菪生物堿類M膽堿受體拮抗藥,臨床用于搶救感染性、中毒性休克,治療血栓、各種神經(jīng)痛以及平滑肌痙攣等。《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部中,氫溴酸山莨菪堿注射液未收載有關(guān)物質(zhì)檢查方法,含量測(cè)定項(xiàng)采用的方法為紫外-可見(jiàn)分光光度法[1]。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法[2]、一階導(dǎo)數(shù)分光光度法[3]和線性滴定微機(jī)計(jì)算法[4]測(cè)定氫溴酸山莨菪堿的含量,筆者未檢索到測(cè)定其有關(guān)物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量,筆者采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿注射液的含量和有關(guān)物質(zhì),該方法簡(jiǎn)便可行,為控制其制劑的質(zhì)量提供科學(xué)方法,也可以作為《中華人民共和國(guó)藥典》再版時(shí)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(包括四元泵,紫外檢測(cè)器,柱溫箱,自動(dòng)進(jìn)樣器,工作站);島津UV2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);Sartorius BP211D型十萬(wàn)分之一天平;KQ-1000型超聲波清洗器;SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 試藥 氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品(批號(hào):100051-201105)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;氫溴酸山莨菪堿注射液(1 m L∶10 mg)為吉林某企業(yè)提供(批號(hào): 20110601,20110602,20110701);氫溴酸(含量40%,分析純,批號(hào):20120801),購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司;HPLC流動(dòng)相所用乙腈為色譜純(Dikma Pure);水為屈臣氏純化水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm);流動(dòng)相:0.1%庚烷磺酸鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)-乙腈(65∶35);流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品適量,用水溶解并稀釋成每毫升中約含1 mg的溶液,搖勻,即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取氫溴酸山莨菪堿對(duì)照品適量,用水溶解并稀釋成每毫升中約含0.02 mg的溶液,搖勻,濾過(guò),即得。

2.2.3 供試品溶液 取氫溴酸山莨菪堿注射液10支,混勻,精密量取適量,加水稀釋成每毫升中約含0. 02 mg的溶液,搖勻,濾過(guò),即得。

2.2.4 有關(guān)物質(zhì)檢查溶液 取氫溴酸山莨菪堿注射液10支,混勻,精密量取適量,加水稀釋成每毫升中約含0.2 mg的溶液,搖勻,濾過(guò),作為供試品溶液。精密量取1 m L,置100 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液。

2.2.5 陰性空白溶液 按處方比例制成不含氫溴酸山莨菪堿的陰性樣品,并按含量供試品溶液的制備方法制得陰性空白溶液。

2.2.6 氫溴酸溶液 精密稱取氫溴酸適量,加水溶解并稀釋成每毫升中含0.04 mg的溶液,搖勻,濾過(guò),即得。

2.3 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取氫溴酸山莨菪堿注射液1 mL,分別加入1 moL·L-1鹽酸溶液、1 moL·L-1氫氧化鈉溶液、3%過(guò)氧化氫溶液各1 mL,室溫放置1 h后中和;另取2份樣品分別置85℃烘箱中2 h、254 nm紫外燈下照射1 d。分別加水定容至50 m L,取20μL注入液相色譜儀。結(jié)果表明,本品經(jīng)酸破壞后,主峰面積略有減小,產(chǎn)生降解峰一個(gè);經(jīng)堿破壞后,主峰幾乎完全消失,產(chǎn)生降解產(chǎn)物峰3個(gè);經(jīng)氧化破壞后,主峰未見(jiàn)減小,產(chǎn)1個(gè)很大的雜質(zhì)峰;本品對(duì)光和熱穩(wěn)定。見(jiàn)圖1。

2.3.2 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法 照“2.1”項(xiàng)色譜條件,取對(duì)照溶液20μL注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主成分峰的峰高約為滿量程的20%;再精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍,供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰,除溶劑峰附近的溴離子峰外,單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5倍(0.5%),各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積(1.0%)。

2.3.3 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 取氫溴酸山莨菪堿注射液3批,照“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定有關(guān)物質(zhì),結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 含量測(cè)定方法

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液0.5,1,2,5,10,20 mL,分別置100 m L量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,以濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo)做線性回歸,得回歸方程:A=31.59C+5.930,r=0.999 8(n=6),線性范圍為5～200μg·m L-1。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,其峰面積的RSD為0.31%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同批號(hào)(批號(hào)1)的樣品6份,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,依法進(jìn)樣分析,測(cè)得平均含量為99.4%,RSD為1.1%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液,分別在0,2,6,10,16,24 h進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。峰面積的RSD為0.6%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 檢測(cè)限和定量限實(shí)驗(yàn) 在選定的色譜條件下,按信噪比為3和10作為檢測(cè)限和定量限,測(cè)得氫溴酸山莨菪堿的檢測(cè)限為15 ng,定量限為50 ng。

圖1 不同降解條件下氫溴酸山莨菪堿的HPLC色譜圖

2.4.6 回收率實(shí)驗(yàn) 取已經(jīng)測(cè)得含量的樣品(批號(hào)1),精密量取1 mL,分別置9個(gè)50 mL量瓶中,分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液(1 mg·mL-1)8,10,12 m L,加水稀釋至刻度,搖勻。精密量取5 m L,置50 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。得相當(dāng)于加樣80%,100%,120%的溶液。精密量取上述溶液各20μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果平均回收率為100.16%,RSD=1.08%(n=9),見(jiàn)表2。

表1 3批樣品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 %

表2 山莨菪堿回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.7 樣品測(cè)定 取3批氫溴酸山莨菪堿注射液,按“2.2”項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液、含量供試品溶液、陰性供試品溶液和氫溴酸溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,并按外標(biāo)法計(jì)算含量,并將該結(jié)果與用“《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部氫溴酸山莨菪堿注射液含量測(cè)定”項(xiàng)下的方法(UV法)測(cè)得的結(jié)果比較,結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

由于HPLC法測(cè)定氫溴酸山莨菪堿的含量筆者未見(jiàn)報(bào)道,因此色譜條件的選擇比較困難。實(shí)驗(yàn)中曾嘗試過(guò)C18、C8色譜柱,磷酸鹽緩沖液、甲酸、離子對(duì)色譜等色譜條件搭配,結(jié)果表明在應(yīng)用C8色譜柱,0.1%庚烷磺酸鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)-乙腈(65∶35)為流動(dòng)相時(shí)得到的峰型最佳,且峰面積重復(fù)性最好。實(shí)驗(yàn)中還曾對(duì)0.1 mg·mL-1的氫溴酸山莨菪堿溶液進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明該物質(zhì)在256 nm處有最大吸收, 210 nm處有較強(qiáng)的末端吸收。在兩個(gè)波長(zhǎng)處主峰均可以得到較好的峰型和重復(fù)性,但是256 nm處時(shí)雜質(zhì)響應(yīng)值偏低,因此最終采用210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表3 紫外法和HPLC法檢測(cè)氫溴酸山莨菪堿注射液含量測(cè)定結(jié)果 %

《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部中未收錄氫溴酸山莨菪堿有關(guān)物質(zhì)的檢查,本研究建立HPLC法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的方法,是對(duì)該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)補(bǔ)充。本研究還與《中華人民共和國(guó)藥典》收載含量測(cè)定方法(UV法)進(jìn)行比較,結(jié)果表明兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但本方法專屬性更強(qiáng),準(zhǔn)確度及精密度更好,操作簡(jiǎn)單,且相對(duì)環(huán)保,能夠?qū)滗逅嵘捷馆袎A注射液的質(zhì)量控制提供充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:556-557.

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.030

R971.9;R927.2

A

1004-0781(2014)06-0797-03

2013-08-21

2013-11-08

曹振民(1972-),男,黑龍江齊齊哈爾人,副主任藥師,碩士,從事臨床藥學(xué)工作。電話:(0)13206615731,E-mail:caozhenmin@163.com。

王超眾(1983-),男,黑龍江齊齊哈爾人,主管藥師,碩士,主要從事藥物分析工作。電話:(0)15845206412, E-mail:wangchaozhongkcn@163.com。