不同濃度雄黃對胃腺癌細胞凋亡的影響

胡少明,張瀛,陶秀良,熊麗萍

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院中西醫結合科,武漢 430030;2.廣州軍區武漢總醫院病理科,武漢 430070)

不同濃度雄黃對胃腺癌細胞凋亡的影響

胡少明1,張瀛1,陶秀良1,熊麗萍2

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院中西醫結合科,武漢 430030;2.廣州軍區武漢總醫院病理科,武漢 430070)

目的 觀察不同濃度雄黃對體外胃腺癌細胞株SGC-7901細胞凋亡的影響。方法采用噻唑藍(MTT)法檢測0,10,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃對胃腺癌細胞SGC-7901增殖抑制率的影響;采用膜聯蛋白Ⅴ/碘化丙啶雙染色法及流式細胞儀檢測0,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃對SGC-7901細胞凋亡的影響。結果10,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃在24和48 h對SGC-7901細胞株的抑制率分別為6.15%,7.54%,42.31%,63.54%以及32.56%,46.14%,64.51%,87.52%,組間差異有統計學意義(P＜0.05)。24和48 h后細胞半數抑制濃度分別約45.23,15.34 μg·mL-1。0,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃作用24 h后誘導的細胞早期凋亡率依次為(11.10±2.10)%,(15.31±1.30)%,(25.81±2.68)%,(43.62±8.51)%,組間差異有統計學意義(P＜0.05);晚期凋亡率依次為(1.84±0.25)%,(4.41±0.09)%,(4.37±0.14)%,(5.00±0.10)%,差異無統計學意義(P＞0.05)。結論高純度雄黃可抑制胃腺癌細胞增殖和誘導細胞早期凋亡。

雄黃;胃腺癌;細胞凋亡

胃癌(gastric cancer,GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一。據美國癌癥協會統計,2013年美國約有21 600例新發胃癌病例,其中男13 230例,女8 370例;并預期有6 740例男性及4 250例女性胃癌患者死亡[1]。胃癌的流行病學有明顯的地域差異,美國及澳洲發病率低,日本、丹麥以及發展中國家發病率高。我國屬胃癌高發地區,由于人口基數大,我國每年新發胃癌病例數占全球的比例40%或40%以上[2],并且具有早期診斷率低、晚期比例大、病死率高和生存率低等特點。由于中晚期胃癌單純依靠手術難以根治,化學治療(化療)聯合分子靶向藥物日益成為晚期胃癌的主要治療方法。胃癌雖對化療相對敏感,但由于胃癌疾病異質性強,目前尚無標準治療方案,即便采用表柔比星+順鉑+氟尿嘧啶(ECF)、多西他賽+順鉑+氟尿嘧啶(DCF)、奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶(FOLFOX)等新含鉑聯合化療方案及分子靶向治療,晚期胃癌患者的5年總生存率仍令人失望。因此,發掘新的有效治療藥物勢在必行。雄黃為硫化物類礦物,在祖國醫學中既往多用于治療癰腫療瘡、蛇蟲咬傷、蟲積腹痛、驚

和瘧疾等。隨著砒霜(As2O3)在治療惡性腫瘤方面取得諸多成果,與之同屬砷劑的另一天然化合物雄黃開始引起人們的關注。近年研究結果表明,雄黃除具有抗炎鎮痛、抑制細菌生長、抗病毒等作用外,尚有一定的抗腫瘤效應[3]。筆者在本研究擬觀察不同濃度高純度雄黃體外對胃腺癌細胞株SGC-7901細胞凋亡的影響,探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 胃腺癌細胞株SGC-7901由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腫瘤科實驗室惠贈。

1.2 主要試劑與儀器 雄黃粉(購自湖北省中藥材公司,經華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部魏世超副主任藥師鑒定為硫化物類礦物雄黃族雄黃),DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)高糖培養液(Hyclone公司,批號:NWM0542),胎牛血清(杭州四季青公司,批號:120112),乙二胺四醋酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)-胰蛋白酶消化液、雙抗溶液(青霉素∶鏈霉素=1∶1)(湖北百奧斯生物科技有限公司),四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]試劑盒,Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所,批號:C0009,C1063),流式細胞儀(美國BDFACS Aria)。

1.3 高純度雄黃的制備 將雄黃及水按體積比1∶2用星式球磨機球磨72 h,制備雄黃微細粉末,加水研磨5 min,再加水攪拌2 min,644×g離心2 min,倒出上清液,重復3次后再用無水乙醇洗3次;旋轉蒸發器干燥后60℃真空減壓干燥制備干燥雄黃粉末,純度大于98%。氯化鉀飽和硝酸溶液溶解,氫氧化鈉溶液調pH至7.0,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)定容,配成2 mg·mL-1的儲備液,經篩孔內徑0. 22 μm濾膜過濾除菌后,4℃保存備用。

1.4 細胞培養 將加入細胞培養液的胃腺癌細胞株SGC-7901置于5%二氧化碳(CO2)、37℃恒溫培養箱培養,用EDTA-胰蛋白酶消化液消化后收集細胞并傳代。

細胞培養液配置:DMEM高糖培養液90 mL,添加雙抗溶液(青霉素100U·mL-1,鏈霉素100 μg·mL-1)1 mL,胎牛血清10 mL,使血清終濃度為10%。

1.5 MTT法檢測藥物對細胞生長抑制作用 取生長對數期狀態良好的細胞消化后稀釋成5×104個·mL-1,接種于96孔板,每孔為100 μL。設置空白對照組(調零孔)、陰性對照組(不加藥物的細胞)和4個藥物組,每組設復孔6個。每次種板2塊(兩個時限)。將2 mg·mL-1雄黃藥物儲備液以DMEM高糖培養液配成濃度梯度10,20,50,80 μg·mL-1。將配制各濃度雄黃溶液于藥物組每孔加100 μL,96孔板周圍加入PBS 100 μL以消除邊緣效應。分別置于5% CO2、37℃培養箱中孵育24,48 h。培養結束前4 h加入MTT工作液50 μL,細胞培養箱內繼續孵育4 h。細胞板底肉眼可見少量紫色結晶,顯微鏡下觀察部分細胞周圍有絲狀結晶狀物質,用100 μL移液槍小心吸去上清液,保留底部紫色結晶,然后加入溶液A 100 μL, 37℃孵育15 min,待紫色結晶完全溶解。

酶標儀570 nm波長檢測各孔的吸光度(A)值,并計算細胞生長抑制率。抑制率(%)=[1-(藥物組A值-本底A值)/(陰性對照組A值-本底A值)]× 100%(本底為無細胞無藥物的調零孔)。重復3次取平均值。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取生長對數期狀態良好細胞同前法消化,將稀釋至1×105個·mL-1的細胞種于6孔板,每孔2 mL。分為陰性對照組及3個藥物組,每組設3個復孔。DMEM高糖培養液配制20,50,80 μg·mL-1濃度梯度雄黃溶液備用。細胞貼壁后取出,PBS洗滌3次,棄PBS,分別加入新配制的各濃度雄黃溶液,每孔2 mL,陰性對照組加DMEM高糖培養液2 mL作為對照,標記后平放入恒溫箱中培養。取培養時限結束的細胞,用不含EDTA的胰酶消化液消化細胞3 min,鏡下觀察細胞間隙出現時,完全培養液終止消化,吹打下全部細胞,收集于離心管內,于644×g離心5 min,棄上清液,PBS洗2次,再離心棄上清液。加入去離子水稀釋后的Binding Buffer(4∶1)500 μL入離心管,懸浮細胞。加入熒光素標記膜聯蛋白Ⅴ(Annexin V-FITC)5 μL混勻后,再加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL混勻。室溫、避光、反應5～15 min后于流式細胞儀下檢測細胞凋亡率。

1.7 統計學方法 用SPSS19.0版軟件統計分析,計量資料用均數±標準差(±s)表示,MTT數據組間比較用多因素方差分析,流式細胞儀測凋亡率比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對胃腺癌SGC-7901細胞株生長抑制作用 MTT法檢測表明,高純度雄黃呈時間和劑量依賴性抑制SGC-7901細胞增殖,各組均差異有統計學意義(P＜0.05),見表1。24,48 h后細胞半數抑制濃度(half inhibitoryconcentration,IC50)分別約45.23, 15.34 μg·mL-1。

2.2 對胃腺癌SGC-7901細胞凋亡的影響 根據MTT試驗結果選擇24 h為作用時限,SGC-7901細胞經0,20,50,80 μg·mL-1高純度雄黃作用24 h,細胞早期凋亡率依次分別為(11.10±2.10)%,(15.31±1.30)%, (25.81±2.68)%,(43.62±8.51)%,凋亡率隨雄黃濃度升高呈濃度依賴性,各濃度組差異有統計學意義(P＜0.05);晚期凋亡及壞死率依次為(1.84± 0.25)%,(4.41±0.09)%,(4.37±0.14)%,(5.00± 0.10)%,晚期凋亡及壞死細胞較對照組明顯增加,但各濃度組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。流式檢測結果見圖1。

表1 不同濃度雄黃對SGC-7901細胞生長抑制作用Tab.1 Growth inhibition of different concentrations of realgar on the SGC-7901 cells ±s

表1 不同濃度雄黃對SGC-7901細胞生長抑制作用Tab.1 Growth inhibition of different concentrations of realgar on the SGC-7901 cells ±s

與0 μg·mL-1比較,*1P＜0.05;與24 h比較,*2P＜0.05Compared with 0 μg·mL-1group,*1P＜0.05;Compared with the same concentration group at 24 h,*2P＜0.05

濃度/ (μg·mL-1) 24 hA值抑制率/% 48 hA值抑制率/% 87.52 00.666±0.0990.000.495±0.0020.00 100.626±0.014*16.150.339±0.027*1*232.56 200.617±0.005*17.540.274±0.008*1*246.14 500.291±0.196*142.310.186±0.112*1*264.51 800.253±0.009*163.540.061±0.023*1*2

3 討論

我國為胃癌高發地區,胃癌年患病率和病死率均為世界平均水平的2倍多[4]。由于我國胃癌患者發現時多為中晚期,即使采用包括姑息手術、放射治療(放療)、化療、分子靶向治療等綜合治療手段,5年生存率依然低下。因此,積極尋找有效治療胃癌的藥物仍是目前亟需解決的重要難題。

圖1 不同濃度雄黃作用SGC-7901細胞24 h后凋亡變化Fig 1 Apoptosis of SGC-7901 cells 24 h after treatment with different concentrations of realgar

雄黃為硫化物類礦物雄黃族雄黃,主含二硫化二砷(As2S2或As4S4),在傳統醫學中有悠久的使用歷史?，F代研究發現,雄黃對人類多種腫瘤如白血病[5]、多發性骨髓瘤[6]、淋巴瘤[7]、宮頸癌[8]、膠質瘤[9]、肺癌[10]、肝癌[11]、卵巢癌[12]等都具有明顯的抗腫瘤作用,其作用機制與誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞分化、抗腫瘤血管形成、調節基因表達有關,顯示良好的應用前景。然而,雄黃難溶于水,傳統的處理工藝如水飛、酸洗、酸奶洗等雖使用多年,但未能解決雄黃的溶解度問題。臨床上雄黃仍以粗糙的原粉入藥,這種單一的給藥方式,嚴重影響其在體內的吸收和分布,限制了臨床應用范圍。近年來,國內曾有學者試圖采用納米技術解決難溶性雄黃的生物利用度問題,降低毒副作用[13]。本實驗采用高能球磨法制備雄黃微細粉末[14],可使制備的雄黃粉末粒徑達到納米級分布,并可通過淘洗除去可溶性雜質三氧化二砷及有機物雜質,是目前解決難溶性雄黃的生物利用度的較理想方法。

本研究結果表明,雄黃對胃腺癌細胞株SGC-7901具有明顯的抑制作用,并呈濃度及時間依賴性,而對細胞凋亡周期的影響主要體現在抑制細胞早期凋亡。凋亡指該類細胞的死亡形態表現為細胞核裂解,然后被細胞質包繞,形成凋亡小體,再被其他細胞吞噬清除,尤如樹葉凋落,周圍沒有炎癥細胞浸潤,不出現炎癥反應。細胞壞死則是指通過炎癥反應徹底破壞細胞內成分,誘導炎癥反應。近年來對抗腫瘤藥物選擇到底是期待凋亡還是壞死存在爭議。有學者認為對于選擇腫瘤藥物,如果藥物導致細胞大量壞死則正常細胞亦難以承受,將會降低藥物安全度。亦有學者認為治療腫瘤應該利用“細胞壞死誘導炎癥反應”機制,并稱部分腫瘤患者在罹患嚴重感染后腫瘤“自發性消退”可能通過該類機制[15]。本研究發現,增加雄黃濃度并不會導致腫瘤細胞晚期凋亡及壞死細胞明顯增多,表明雄黃在腫瘤治療中主要表現在抑制腫瘤細胞的早期凋亡,細胞壞死少,藥物安全性相對高,但尚需進一步行動物體內藥物試驗評估其效價的優劣。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.013

Effects of Different Concentrations of Realgar on the Apoptosis of Gastric Adenocarcinoma Cells

HU Shao-ming1,ZHANG Ying1,TAO Xiu-liang1,XIONG Li-ping2
(1.Department of Integrated Traditional Chinese Medicine&Western Medicine,Tongji Hospital Affiliated with Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Department of Pathology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo observe the effect of different concentrations of realgar on the apoptosis of gastric adenocarcinoma cell Line SGC-7901.MethodsMTT assay was conducted to detect the growth inhibition ratio of SGC-7901 cells treated by different concentrations of realgar(0,10,20,50 and 80 μg·mL-1).AnnexinⅤ/Propidium iodide double staining method together with flow cytometry were used to detect the effect of realgar at 0,20,50 and 80 μg·mL-1on the apoptosis of SGC-7901 cells.ResultsThe growth inhibition ratio of SGC-7901 cells by various concentrations of high-purity realgar(10,20,50 and 80 μg·mL-1)was 6.15%,7.54%,42.31%and 63.54%,respectively,24 h after realgar treatment.At 48 h after the treatment,the growth inhibition ratio rose to 32.56%,46.14%,64.51%and 87.52%,respectively(P＜0.05).Half inhibitory concentration was 45.23 μg·mL-1after 24 h and 15.34 μg·mL-1after 48 h.After treated by various concentrations of pure realgar(0,20,50 and 80 μg·mL-1)for 24 h,early cell apoptosis rate was(11.10±2.10)%,(15.31±1.30)%,(25.81±2.68)%and(43.62± 8.51)%,respectively,significantly different among the four groups(P＜0.05).The late cell apoptosis rate in each group was (1.84±0.25)%,(4.41±0.09)%,(4.37±0.14)%and(5.00±0.10)%,respectively(P＞0.05).ConclusionHigh purity realgar can inhibit the proliferation and induce early apoptosis of gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells.

Realgar;Gastric adenocarcinoma;Apoptosis

R285.5;R965

A

1004-0781(2014)10-1306-04

2014-02-18

2014-04-20

胡少明(1955-),男,湖北武漢人,主任醫師,學士,研究方向:腫瘤中西醫結合治療。電話:027-83663217,E-mail:smhu@tjh.tjmu.edu.cn。

熊麗萍(1972-),女,江西九江人,主治醫師,碩士,研究方向:腫瘤病理學。電話:027-50772675,E-mail:ripplexiong@hotmail.com。