不同濃度的胎牛血清對骨髓間充質干細胞純度及周期的影響

陳小丹，何家才

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是成熟體細胞的亞群，又稱為基質干細胞，是治療中應用間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的基礎。MSCs具有黏附能力并且能夠在體外擴增;多分化潛能:在特定的生理或是實驗條件下能分化為特定的功能細胞、組織、器官，同時免疫抑制的能力［1］;這些特點使其成為組織工程再生醫學中理想的種子細胞［2］。然而BMSCs的含量極低，因此很難在短期內獲得大量的BMSCs。分離擴增大量的原始干細胞成為研究和應用干細胞的先決條件。但其增殖和生長受很多因素影響，因此找到一個既簡單又可行的方法是在短期內獲得大量BMSCs的重要問題。目前，體外培養BMSCs的完全培養液中大部分都加 FBS，而文獻［3－6］報道中關于BMSCs體外培養的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的濃度不盡一致。不同濃度的FBS對其生物學特性研究較少，該文探討3種不同濃度的FBS對BMSCs的純度及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠15只，4周齡，普通級，體重75～100 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 L－DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶(澳洲 Hyclone公司);熒光標記抗大鼠CD29－PE、CD45－PE(美國 Biolegend 公司);CD44－FITC、CD90－FITC(美 國 Santa Cruz 公 司);Axiovert200倒置相差顯微鏡(德國Zelss公司);流式細胞儀(美國BD公司);超凈工作臺(中國蘇州凈化公司)、CO2細胞培養箱(美國Thermo公司);冷凍離心機(美國Beckman公司);酶聯免疫檢測儀(美國BioTek公司);CCK－8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(上海貝博生物試劑公司);細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離、培養 以頸椎脫臼法處死大鼠，置于體積分數為75%乙醇溶液中消毒5～7 min，在超凈臺中取出股骨和脛骨，然后放到另一杯乙醇溶液內消毒5～6 s后用PBS洗3遍，再置于PBS內。用注射器抽吸完全培養基反復沖洗骨髓腔，直至股骨和脛骨兩端發白，然后按細胞濃度1×109/L將細胞懸液加入至培養瓶內，隨后將培養瓶置于37℃、5%CO2細胞培養箱內培養。2 d后首次半量換液，以后每3 d全量換液1次，每次換液去除懸浮的雜細胞。

1.2.2 BMSCs的傳代培養 當細胞生長至80% ～90%融合時，用PBS洗細胞2～3次，然后加入胰蛋白酶1 ml消化 1.5～2.0 min，在鏡下見間隙增寬，細胞變圓，有少量細胞懸浮時立刻加含體積分數為0.10 FBS的完全培養基終止消化。然后制備成細胞懸液，離心，去上清液，以相應的培養基重懸細胞后并按1×107/L傳代，記為第1代(P1)，以此類推第2、3、4、5 代記為 P2、P3、P4、P5。傳代時嚴格控制胰酶的時間，將淋巴細胞、單核細胞等去除。

1.2.3 BMSCs的鑒定 實驗分為A、B、C 3組分別為用 0.10、0.15、0.20 的完全培養基培養的 BMSCs，取A、B、C原代第72小時和第9天的細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況并拍照記錄細胞形態。

1.2.4 流式細胞儀檢測 BMSCs表面標志 取A、B、C 3組原代細胞，2 d后首次半量換液，以后2～3 d全量換液1次，當細胞長至80% ～90%融合時，用0.25%的胰酶消化傳代記為P1，然后依次傳代下去記為P2、P3、P4、P5。用PBS洗洗滌這3種培養基培養的2、3、4、5 代細胞2 ～3 次，棄上清液，余 100 μl，配成終濃度為1×106/ml的細胞懸液。分別加入CD29－PE、CD45－PE(1.25 μl)，CD44－FITC、CD90－FITC(20 μl)，及同型對照，4 ℃避光孵育 30 min，之后再用PBS洗細胞2～3次，棄上清液，加入500 μl PBS，制備成單細胞懸液，上流式細胞儀，檢測PE、FITC標記的細胞占細胞總數的百分比進行表面抗原測定。

1.2.5 不同濃度的FBS對BMSCs細胞周期的影響取生長轉態良好的P3細胞，用PBS洗細胞2次，然后用0.25%的胰酶消化1.5～2.0 min，按細胞濃度為1.0×109/L傳代至12個一次性細胞培養瓶，每4瓶分為一組，隨機分為3組，3～5 h后細胞鐵貼壁，棄去原培養液，分別加入含體積分數為0.10、0.15、0.20 的 FBS 的 L－DMEM 培養液，在 5%CO2、37℃培養箱內孵育，分別將相應培養基孵育24、48、72、96 h的BMSCs用PBS洗洗滌細胞2～3次，70%乙醇固定過夜，次日PBS沖洗去乙醇，加入100 μl RnaseA，混勻，37 ℃水浴 30 min，然后加入 40 μl PI染液，4℃避光30 min，然后上機檢測相應培養基孵育后的 24、48、72、96 h 的 BMSCs的周期。

1.2.6 不同濃度的FBS對BMSCs活力的影響 收集P3 BMSCs，調整細胞數制備細胞懸液，以密度為5×104/ml接種于6個96孔板中，每孔加FBS體積分數是 0.10、0.15、0.20 的完全培養基制備的細胞懸液100 μl，置5%CO2、37 ℃ 培養箱內孵育。于第1、2、3、4、5、6 天各取1 塊板，每孔加 10 μl CCK－8 溶液，37℃孵育3 h，用酶聯免疫檢測儀測定波長為450 nm時各孔的吸光度值(optical density，OD)。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計軟件分析，數據以±s表示，采用單因素方差及t檢驗分析多組間的差異。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測BMSCs表面標志 BMSCs經流式細胞儀檢測結果顯示，單標時CD29陽性率97.77%，CD90 陽 性 率 98.04%，CD44 陽 性 率99.38%，CD45陽率 1.96%;雙標結果進一步顯示BMSCs高表達 CD29、CD90、CD44，低表達 CD45，見圖1。取分別用含體積分數為 0.10、0.15、0.20 3 種完全培養基培養的P2～P5 BMSCs進行流式細胞術進行分析，A、B、C 3組細胞表面標志物在P3、P4均能獲得較純的BMSCs，其表達率依次為:CD45平均表 達 率 為 4.29%、3.28%、1.80%;CD29 為93.23%、95.43%、93.94;CD44 為 91.27%，95.31%、94.92;CD90 為 95.55%、95.66%、95.05%，見表 1。

2.2 BMSCs的形態學觀察 原代培養:用3種含不同體積分數的完全培養基培養的BMSCs在剛接種到各自的培養瓶時，細胞呈大小不一的圓形，懸浮于培養液內。72 h后半量換液去除沒有貼壁的細胞，此時可見到多數細胞貼壁，呈圓形、類圓形，多角形，少數細胞伸展成長梭形，A、B、C 3組的貼壁細胞數依次增加，見圖2a、b、c。以后每2 d全量換液，不斷地去除雜細胞。到第9天時，細胞已鋪滿瓶底，呈現形態均一的長梭形，排列成漩渦狀，魚群狀，A、B、C 3組均已鋪滿瓶底，C組密度最大，其次B組，A組相對 B、C 兩組較疏，見圖2d、e、f。

表1 3種不同濃度的胎牛血清中第2、3、4、5代BMSCs免疫表型流式檢測結果

圖1 流式細胞術檢測細胞(P3)表面標志結果

圖2 BMSCs的形態學觀察圖 ×100a、b、c:A、B、C 3 組 BMSCs培養后 72 h;d、e、f:A、B、C 3 組 BMSCs第9天

2.3 流式細胞儀檢測BMSCs周期變化 表2顯示，3種完全培養基中的BMSCs的G0/G1期隨濃度的增加而降低，但差異無統計學意義，同一濃度隨時間的延長也是降低;G2/M期在24 h后0.10與0.15組無差異，0.15 與 0.20 和 0.10 與 0.20 組有差異(F=12.412，P ＜0.05)，但隨時間的延長無差異。24、48、72、96 h 4個時間點 S期的結果在3種完全培養基中差異無統計學意義，S+G2/M期在4個時間點隨濃度的增加而增加。3種完全培養基培養24、48、72、96 h 的 BMSCs的細胞周期見圖3。

2.4 隨著時間變化3種不同濃度培養基中的BMSCs的活力情況 在接種到96孔板的第1天A、B、C 3組的OD值依次增大，三者之間差異有統計學意義(P ＜0.05，F=5.002)，隨著時間的延長三者的OD值無明顯差異，見圖4。

3 討論

MSCs存在于許多組織器官內，首次是在骨髓內被鑒定出來，主要特點是體外培養時具有黏附、自我更新能力，保持未分化特點，分化為成骨、成軟骨和脂肪細胞［7］，這是MSCs最基本的功能，此外還可以向管狀上皮細胞［8］，肝細胞等［9］分化，因具有以上功能因此被廣泛的應用于組織工程、基因治療、細胞治療，被用來運送生物制劑和檢測新植入材料的生物相容性。

圖3 流式細胞術檢測3種完全培養基中24、48、72、96 h的BMSCs的細胞周期

表2 細胞周期結果(n=4，%，±s)

表2 細胞周期結果(n=4，%，±s)

與體積分數(0.20)比較:*P ＜0.05

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圖4 3種培養基中的BMSCs在培養 1、2、3、4、5、6 d 的活力變化情況

目前分離BMSCs的方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法、免疫磁珠法、骨髓過濾裝置［10］，后3種方法易損傷細胞活性，過程繁雜，前2種方法培養的細胞在前2代有差別，但至P3均已無差異。因此該文選取簡單易行且能夠獲得足夠數量與純度的第一種方法。

至目前，對BMSCs的鑒定尚沒有統一的方案。一般是通過以下方法來鑒定:首先，黏附能力;其次:多分化潛能;最后:表面標志，BMSCs無特異性表面標志，因屬于非造血干細胞所以不表達 CD11、CD14、CD34 和 CD45，高 表 達 CD29［11］、CD44、CD73、CD271［12］、CD90、STRO－1 和 CD1 偶05/SH2。因為抗大鼠的抗體非常少，因此本文選擇CD45－PE、CD29－PE、CD44－FITC、CD90－FITC 做為鑒定干細胞的標志。本文實驗結果顯示，CD45呈低表達而CD44、CD90、CD29高表達。細胞周期結果顯示，P3細胞85%以上處于G0/G1期，說明是干細胞。

FBS含有BMSCs生長和增殖所需要的物質如生長因子:TGF－β1、β3、FGF－2 等，因此都要在基礎培養液里加FBS［13］，但是關于適宜濃度，不同的文獻報道不盡一致。有的實驗結果顯示11%FBS的完全培養基最適合BMSCs的增殖［3］，有的研究結果顯示 15%［4］、20%［5］的完全培養基中 BMSCs 顯示出最高的增殖能力，還有報道10% ～20%有利于BMSCs的增殖，傳統的培養基是DMEM加10%的FBS。本實驗結果與傳統的結論一致，10%的完全培養基已經適合BMSCs的體外擴增培養。不同的結果也許是由于每1批次的FBS不同，槍頭準確性，或是BMSCs培養傳代的過程中胰酶消化時間，傳代方法不同等原因，這些都會影響其相關特性和分化的能力，進行實驗前建議進行FBS批次的檢測。

細胞周期包括間期和分裂期2個階段，間期包括G0/G1期、S期、G2/M期，在此期間進行著復雜的物質合成和能量儲備。不同濃度FBS對BMSCs周期的影響是不同的，主要發生在間期內。該實驗結果顯示隨著時間的增加，3種完全培養基G0/G1期減少，S期+G2/M期減低，均能促進BMSCs的增殖，3期中只有G2/M期在24 h時3組之間差異有統計學意義，3組的G0/G1期、S期、G2/M期在其余各個時間點差異均無統計學意義。

FBS內含有營養物質和生長因子，濃度的不同會影響BMSCs的增殖、分化、基因表達、穩定性和活力。OD值可以間接反應細胞的活力。不同濃度的FBS對BMSCs活力的影響在第1天有差異，但在以后的5 d 3組活力相當，沒有差異，說明含體積分數為0.10 FBS的完全培養基已滿足BMSCs的活力，與細胞周期結果吻合。

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