HPLC-ECD法測定大鼠腦組織中單胺類神經遞質的含量Δ

韋姍姍，陸雪萍，彭玲芳，屈會化，孫曄，王慶國#（1.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學“經典方劑的應用基礎研究”創新團隊，北京 100029；.云南省藥物研究所，昆明 650111）

單胺類神經遞質是重要的神經信息傳遞物質，廣泛存在于中樞神經以及外周組織內，主要包括去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、腎上腺素（Epinephrine，E）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）等，目前認為精神類疾病與其關系密切[1]。市場上現有的抗抑郁藥物主要是基于腦內單胺類神經遞質水平過低的機制開發的[2]。因而準確測定腦組織中單胺類神經遞質的含量對于抗抑郁藥物的藥效與機制研究具有重要的意義。目前關于腦內單胺遞質的檢測方法很多，其中高效液相色譜-電化學（HPLC-ECD）法是報道最多、應用最廣的方法。現有文獻中流動相主要采用等度洗脫，而NE極性較強，反相柱吸附能力較弱，因而出峰快；而5-HT極性較弱，出峰慢，若采用等度洗脫，存在NE峰分離度差或者5-HT出峰時間過長的問題。因此根據本實驗室的條件，筆者建立了一種實用、靈敏、簡便的HPLC-ECD梯度洗脫方法，能快速同時測定大鼠不同腦區內NE和5-HT的含量，為進一步研究單胺類神經遞質奠定方法學基礎。

1 材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀及2465電化學檢測器（美國Waters公司）；5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑:9.5 cm）；AG285電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

NE標準品（哥倫比亞Matrix Scientific公司，批號:037692，供含量測定用）；5-HT標準品（批號:91M5163V，供含量測定用）和內標2，5-二羥基苯甲酸（DHBA，批號:MKBG3214V）均購自美國Sigma公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為高純水。

1.3 動物

SD大鼠15只，♀，SPF級，體質量300～350 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號為:SCXK（粵）2008-0002。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 蛋白沉淀液。取濃高氯酸溶液和乙二胺四乙酸（EDTA）適量，稀釋為含高氯酸0.1 mol/L和EDTA 0.1 mmol/L的蛋白沉淀液。

2.1.2 標準品溶液。精密稱取NE、5-HT標準品適量，以蛋白沉淀液溶解，分別配制成質量濃度為21 μg/ml和5 μg/ml的貯備液，臨用前用蛋白沉淀液稀釋成NE質量濃度為0.084、0.252、0.42、0.84、2.1、4.2 μg/ml，5-HT質量濃度為0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.25 μg/ml的系列標準品溶液。

2.1.3 內標工作液。精密稱取DHBA適量，用蛋白沉淀液溶解配制成質量濃度為4 mg/L的溶液。

2.1.4 樣品溶液。大鼠脫頸椎處死，開顱迅速取出整個腦組織，分離各腦區，用適量0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水）沖洗，用吸水紙吸干，稱質量，以一定比例加入蛋白沉淀液，冰浴下手動勻漿，取勻漿液14000 r/min低溫離心30 min，取上清液再14000 r/min低溫離心25 min，取一定量上清液按比例加入一定量的內標工作液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為DIKMA C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:緩沖鹽溶液[100 mmol/L醋酸鈉、3 mmol/L庚烷磺酸鈉、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、85 mmol/L檸檬酸]-甲醇，梯度洗脫，流速:1.0 ml/min；工作電壓:+0.7 V；柱溫:25℃；進樣量:20μl。流動相洗脫程序見表1。

2.3 系統適用性研究

取NE和5-HT混合標準品溶液+內標、空白溶劑（蛋白沉淀液）進樣測定，記錄色譜；另取大鼠大腦皮層樣品、小腦樣品、海馬樣品、下丘腦樣品、嗅球樣品，按“2.1.4”項下方法制成溶液，進樣測定，記錄色譜。結果標準品和腦組織中的各峰形對稱，內源性雜質無干擾，NE、內標、5-HT的保留時間分別約為5、8、18 min，NE、5-HT達到良好分離。色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution conditions

圖1 高效液相色譜圖A.標準品+內標；B.空白溶劑；C.大腦皮層樣品；D.小腦樣品；E.海馬樣品；F.下丘腦樣品；G.嗅球樣品Fig 1 HPLC chromatogramsA.standard substance+internal standard；B.blank solvent；C.pallium sample；D.cerebellum sample；E.hippocampus samples；F.hypothalamus sample；G.apophysis mamitlaris sample

2.4 線性范圍考察

由于腦組織中原本就含有NE、5-HT，故不能直接用腦組織進行線性范圍考察。故用蛋白沉淀液將標準品溶液稀釋成含 NE 0.084、0.252、0.42、0.84、2.1、4.2 μg/ml，含 5-HT 0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.25 μg/ml的系列混合標準品溶液，按比例加入內標溶液，進樣測定。以質量濃度（x）為橫坐標、標準物質的峰面積與內標峰面積的比值（y）為縱坐標進行回歸分析。得NE回歸方程為y＝5.292x－0.1474（r＝0.9999），檢測質量濃度線性范圍為0.084～4.2 μg/ml；5-HT回歸方程為y＝59.057x－0.1303（r＝0.9991），檢測質量濃度線性范圍為0.005～0.25 μg/ml。

2.5 提取回收率試驗

取一定量的NE標準品2份，其中1份加入全腦樣品溶液，處理后測得NE峰面積記為A1；1份加入蛋白沉淀液并稀釋至相同濃度，測得NE峰面積記為A3；另外測得全腦樣品溶液（未加標準品）的NE峰面積記為A2；計算NE提取回收率＝（A1－A2）/A3×100%。同法測得5-HT的提取回收率，結果見表2。

表2 提取回收率試驗結果（n＝3）Tab 2 Results of extraction recovery tests（n＝3）

2.6 加樣回收率試驗

因NE、5-HT為內源性物質，故用加入法測定回收率，即向已知濃度的全腦樣品溶液中加入一定量的NE、5-HT標準品溶液，處理后進樣測定，計算方法回收率＝（測得量－樣品含量）/加入量×100%，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab 3 Results of recovery tests of added index（n＝3）

2.7 精密度試驗

取同一份全腦樣品，加入NE、5-HT標準品溶液制備成高、中、低3種質量濃度的樣品溶液，分別于同日內0、2、4、6、8 h重復測定5次，考察精密度。結果NE的RSD＝2.76%（n＝5），5-HT的RSD＝3.00%（n＝5），表明本方法精密度良好。

2.8 穩定性試驗

將已知NE、5-HT質量濃度的樣品溶液3份，分別置于常溫下存放，于處理后第1、2、3天測試其含量，考察樣品穩定性。結果NE的RSD＝1.87%（n＝3），5-HT在第2天含量有大幅下降，表明腦組織中NE在常溫下至少能穩定3 d，而5-HT僅能穩定1 d。

2.9 樣品含量測定

根據“2.1.4”項下的制備方法，分別制備6只大鼠的大腦皮層樣品溶液、小腦樣品溶液、海馬樣品溶液、下丘腦樣品溶液、嗅球樣品溶液，測定其中NE、5-HT含量，結果見表4。

表4 NE、5-HT在大鼠不同腦區中的水平（，mg/g，n＝6）Tab 4 The levels of NE and 5-HT in different parts of brain in rat（s，mg/g，n＝6）

表4 NE、5-HT在大鼠不同腦區中的水平（，mg/g，n＝6）Tab 4 The levels of NE and 5-HT in different parts of brain in rat（s，mg/g，n＝6）

被測物NE 5-HT嗅球0.864±0.100.086±0.04大腦皮層0.411±0.120.383±0.21小腦0.343±0.140.059±0.04海馬1.654±0.800.135±0.09下丘腦3.062±1.510.206±0.12

由表4結果可知，NE在下丘腦中含量最高，海馬次之，小腦最低；5-HT在大腦皮層中含量最高，下丘腦次之，小腦最低。說明單胺類神經遞質在♀大鼠腦中分布不均一，與張燕等[3]報道一致。

3 討論

單胺類神經遞質結構不穩定，極易分解，且腦組織樣品量少，成分復雜，神經遞質含量極微。因此建立一套完整、詳細、可重復的含量分析方法尤為重要。

根據文獻[4-7]，筆者先后進行了4種不同流動相[（1）緩沖鹽溶液（無水乙酸鈉2.0 g、檸檬酸5.5 g、EDTA-2Na 60 mg、NaCl 584.4 mg、1.0 mmol/L庚烷磺酸鈉2 ml制成500 ml）-甲醇（97∶3）；（2）緩沖鹽溶液（0.1 mol/L磷酸二氫鉀、0.01 mol/L庚烷磺酸鈉、0.1 mol/L EDTA-2Na，用0.1 mol/L磷酸調pH為3.6）-甲醇-乙腈（78∶19∶3）；（3）緩沖鹽溶液（0.1 mol/L磷酸二氫鈉、0.85 mmol/L庚烷磺酸鈉、0.5 mmol/L EDTA-2Na，用0.1 mol/L磷酸調pH為3.4）-甲醇（94∶6）；（4）“2.2”項下流動相]的實驗摸索。前3種流動相出現了NE峰未能有效分離或者5-HT峰有明顯拖尾現象的現象，最終確定采用“2.2”項下流動相。結果表明，在此流動相條件下，NE、5-HT及內標均可達到有效的分離。實驗發現，增大甲醇的比例不改變各物質的出峰順序，而且可以明顯縮短各物質的保留時間，尤其是對5-HT影響較大，但甲醇比例過大多會使NE出峰過早，與雜質峰重疊，影響分析結果。于是筆者改變了以往文獻等度洗脫的方法，采用梯度洗脫，既可使各物質保持良好的分離度，又可以縮短5-HT的保留時間。

在標準品溶液稀釋液的選擇上，本實驗分別考察了蛋白沉淀液、0.1 mol/L HCl以及流動相，發現采用流動相及HCl后色譜峰干擾大，因此，最終確定標準品溶液稀釋液為蛋白沉淀液。

多數文獻選用0.1 mol/L的高氯酸作為蛋白沉淀液，因其除蛋白質峰效果最好、雜質最少，但未明確加入量。若蛋白沉淀液加入過多，會使峰形過于低平，且高氯酸濃度過高會引起神經遞質氧化分解；若加入過少，蛋白質會對峰形產生干擾或無法勻漿。經過反復試驗，確定加入比例為:＞100 mg的組織按1 mg ∶2.5 μl的比例加入，＜100 mg的組織按200 μl加入。這樣既能有效沉淀蛋白，又不干擾峰形。

在操作過程中應盡量避光及在冰水浴中低溫下操作。樣品經前處理后應立即檢測或分裝保存在－80℃的冰箱中。含量分析時，如果具備進樣器控溫模塊，應將溫度調節至4℃為佳；如無此模塊，則NE在常溫下至少能穩定3 d，而5-HT只能穩定1 d。

[1]陳潔，黃宏平.應激導致抑郁癥與單胺類遞質系統穩態[J].生物學雜志，2013，30（1）:78.

[2]張廣芬，周志強，喬慧芬.抗抑郁藥研究新方向[J].臨床精神醫學雜志，2012，22（3）:203.

[3]張燕，王洪斌，楊海霞，等.熒光分光光度法測定大鼠不同腦區單胺類神經遞質[J].東北農業大學學報，2010，41（1）:93.

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[7]譚炳炎，鄭琳，馮翔.高效液相色譜-電化學法測定大鼠血液和腦組織中單胺類物質的含量[J].分析測試學報，2006，25（2）:90.